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檢驗(yàn)技師考點(diǎn):多克隆抗體的純化

時(shí)間:2024-09-12 06:18:21 檢驗(yàn)技師/士 我要投稿
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檢驗(yàn)技師考點(diǎn):多克隆抗體的純化

  多抗的純化是一件比較簡(jiǎn)單的事情,因?yàn)槿斯じ深A(yù)比較大,所以對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作依賴性較強(qiáng)。很多新手覺得這是一件比較復(fù)雜困難的工作,但是如果理解了原理,就可以自行改進(jìn)實(shí)驗(yàn)了。多抗純化方法比較多,過(guò)去有用鹽析法純化的,有用辛酸-硫酸銨沉淀的方式純化的,也有用冷酒精沉淀的方式純化的,也有后來(lái)的離子交換層析和Protein A,G,A/G純化的,但是在今天,市場(chǎng)上幾乎所有的抗體都是通過(guò)抗原親和純化得到的,與其它方法相比,抗原親和層析得到的抗體效率高、產(chǎn)量高、產(chǎn)品純、操作簡(jiǎn)單。

  操作方法:

  免疫方法

  可以采用以下各種方法之一進(jìn)行免疫。

  (1)淋巴結(jié)注射法:①在兔的兩后足跖部皮下(或皮內(nèi))注射活卡介苗 50mg(每側(cè)約0.30ml) 。7~10 天后,兔跖及腘肌淋巴結(jié)腫大;②于腫大的兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的IgG 乳化抗原 0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、鏈霉素 1 000μg/ml);③必要時(shí),14 天后,重復(fù)步驟②一次;④再過(guò) 7 天后,于兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的 IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、鏈霉素 1 000μg/ml) ;⑤5~7天后,耳靜脈采血。測(cè)定血清效價(jià)。

  (2)皮下多點(diǎn)注射法:①家兔兩側(cè)掌(跖內(nèi)各注射含有完全佐劑抗原 0.10ml(IgG 含量5mg/ml) ;②7~10 天后,脊柱兩側(cè)多點(diǎn)(頸、胸、腰椎各兩點(diǎn)、共 6 點(diǎn))皮下注射含不完全佐劑5的抗原,每點(diǎn) 0.50ml;③7~10 天后,脊柱兩側(cè)重復(fù)注射一次;④7~10 天后試血。不合格者重復(fù)步驟③。

  (3)多途徑聯(lián)合注射法:①兩側(cè)掌(跖)內(nèi)側(cè)皮下注射含完全佐劑抗原 0.50ml(IgG 量為 5mg/ml) ;②14 天后,多點(diǎn)皮下注射含有不完全佐劑抗原;③7 天后,耳靜脈注射不含佐劑的抗原 2ml;④測(cè)定血清抗體效價(jià),不合格者重復(fù)步驟③,并適當(dāng)遞增 IgG 量。

  效價(jià)測(cè)定

  采用瓊脂擴(kuò)散法。

 、 將血清倍比稀釋,加入外周孔。

 、 中間孔加動(dòng)物 Ig。

 、 37℃濕盒瓊擴(kuò) 24 小時(shí),觀察結(jié)果。

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