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微生物檢測手段及注意事項
微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實踐中都具有重要的意義，本文對生長量測定法、微生物計數(shù)法、生理指標法和商業(yè)化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十余種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點。下面是yjbys小編為大家?guī)淼奈⑸餀z測手段及注意事項的知識，歡迎閱讀。
1. 微生物計量法
1.1 體積測量法
又稱測菌絲濃度法，通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養(yǎng)液(如10 mL)放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時間(如5 min)和轉(zhuǎn)速(如5000 rpm)，離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有一定偏差。
1.2稱干重法
可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將一定體積待測培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時間和轉(zhuǎn)速，進行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
1.3 比濁法
微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600 nm處用比色管定時測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長及誘導時間。
1.4 菌絲長度測量法
對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定一定時間內(nèi)菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。
2. 微生物計數(shù)法
2.1 血球計數(shù)板法
血球計數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進行計數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
2.2 染色計數(shù)法
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細胞和活細胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。借助不同的染料對菌體進行適當?shù)娜旧�，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數(shù)。如酵母活細胞計數(shù)可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。
2.3 比例計數(shù)法
將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標準。
2.4 液體稀釋法
對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN(Most Probable Number)得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
2.5 平板菌落計數(shù)法
這是一種最常用的活菌計數(shù)法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50~500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。
2.6 試劑紙
在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數(shù)快捷準確，相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。
2.7 膜過濾法
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發(fā)橙色熒光，而死細胞則發(fā)綠色熒光。
3. 間接測定法
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。因此可利用生理指標等間接參數(shù)來測定生物量。
3.1 測定含氮量
大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2后即可測出N2的量。
3.2 測定含碳量
將少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或無機緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。
3.3還原糖測定法
還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。
3.4 氨基氮的測定
離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。
3.5 其他生理物質(zhì)的測定
P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2(用標記葡萄糖做基質(zhì))，耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標，都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時監(jiān)測溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細菌的長勢。
4. 商業(yè)化快速微生物檢測法
微生物的檢測，其發(fā)展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學微生物檢測和科學研究領(lǐng)域。例如：
4.1 試劑盒，培養(yǎng)基等手段
抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統(tǒng)奠定了堅實的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測試劑盒等，可方便的用于多項檢測。
4.2 借助新型先進儀器
BACTOMETER全自動各類總菌數(shù)及快速細菌檢測系統(tǒng)可以數(shù)小時內(nèi)獲得監(jiān)測結(jié)果，樣本顏色及光學特征都不影響讀數(shù)，對酵母和霉菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(Impedance Technology)將待測樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長時可將培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測微生物的存在及數(shù)量。測定項目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。
微生物OD值是反映菌體生長狀態(tài)的一個指標，OD是Optical Density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測定的范圍，需要紫外分光光度計測最大吸收波長。用得最多的是：505 nm測菌絲菌體、560 nm測酵母、600 nm測細菌。用測OD方法畫微生物生長曲線時，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準備多管(根據(jù)檢測點的需要，如需檢測10個點，就準備10管)，然后每個點取一管出來測OD值就行了。
一般測菌體密度的OD的波長范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)(200 nm～400 nm為紫外光區(qū)，400 nm～800 nm為可見光區(qū))。空白如用水做，需要離心洗滌菌體;空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時培養(yǎng)以求條件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在這個區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀釋后再測，因為OD太大，分光光度計的靈敏度就會顯著降低。
一般都測吸光值，而且最好是整個實驗過程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不一定成正比，可保證整個實驗點有可比性。且取值的時候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。
另，用分光光度計測微生物的OD值為什么要把波長設(shè)為600 nm
這個波長其實只是針對濁度，而分光光度計在600 nm處對濁度的反應(yīng)比較靈敏。測吸收峰的實際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過夜的大腸桿菌，其實在400多納米處的吸收最大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。
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