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免疫檢測(cè)方法大全2017
免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的用途非常廣泛，它們可用于有關(guān)免疫疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)及發(fā)病機(jī)制的研究。如對(duì)傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應(yīng)、自身免疫病、移植排斥反應(yīng)腫瘤的免疫學(xué)檢測(cè)，對(duì)診斷、治療均有很大幫助。此外在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中對(duì)抗原性物質(zhì)或細(xì)胞的定性、定量檢查不僅推動(dòng)了對(duì)各種免疫學(xué)現(xiàn)象的研究，而且擴(kuò)大免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)生物許多領(lǐng)域的聯(lián)系。本章僅介紹常用免疫學(xué)檢測(cè)方法的原理，簡(jiǎn)要過(guò)程和實(shí)用意義。下面是yjbys小編為大家?guī)?lái)的關(guān)于免疫學(xué)檢測(cè)法的知識(shí)，歡迎閱讀。
第一節(jié) 抗原或抗體的檢測(cè)
一、檢測(cè)的原理
借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。
1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結(jié)合就像酶與底物的結(jié)合，激素與其受體的結(jié)合一樣不是化學(xué)的反應(yīng)，而是非共價(jià)鍵的可逆的結(jié)合�？乖瓫Q定簇和抗體分子可變區(qū)互補(bǔ)構(gòu)型，造成兩分子間有較強(qiáng)的親和力�？臻g構(gòu)型互補(bǔ)程度不同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強(qiáng)弱也不同�；パa(bǔ)程度高，則親和力強(qiáng)。此外，反應(yīng)溫度、酸堿度和離子濃度對(duì)抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結(jié)合力大小可用親合力來(lái)表示。高親合力的抗體與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，即使抗原濃度很低時(shí)也有較多的抗體結(jié)合抗原形成免疫復(fù)合物。
2.抗原或抗體外檢測(cè)原理根據(jù)抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的性狀與活性特點(diǎn)，對(duì)標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。定性和定位檢測(cè)比較簡(jiǎn)單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，若有免疫復(fù)合物形成的現(xiàn)象發(fā)生，就說(shuō)明待檢樣品中有相應(yīng)的抗原存在。若無(wú)預(yù)期的現(xiàn)象發(fā)生，則說(shuō)明樣品中無(wú)相應(yīng)的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測(cè)樣品中是否有相應(yīng)抗體。
對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，以反應(yīng)中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復(fù)物的濃度呈函數(shù)關(guān)系。
(1)根據(jù)免疫復(fù)合物產(chǎn)生的多少來(lái)推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應(yīng)條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物多少與待檢樣品中含有相應(yīng)抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時(shí)，免疫復(fù)合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實(shí)驗(yàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫比濁試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫檢測(cè)等都屬于這類方法。
(2)抗原或抗體效價(jià)滴定的原理：當(dāng)抗原抗體復(fù)合物形成多少不能反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱時(shí)，就不能以檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度來(lái)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量。在實(shí)際工作中，把濃度低的反應(yīng)成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應(yīng)成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產(chǎn)生抗體的多少，即滴定3只兔血清抗體效價(jià)，可用雙向瓊脂擴(kuò)散法來(lái)滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應(yīng)小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現(xiàn)明顯沉淀淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價(jià)為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產(chǎn)生抗體的效價(jià)要高)。也就是表示效價(jià)的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應(yīng)稀釋抗原。
二、抗原或抗體檢測(cè)的實(shí)用意義
1.抗體檢測(cè)的意義檢測(cè)抗體可用于評(píng)價(jià)人和動(dòng)物免疫功能的指標(biāo)�？贵w用于臨床治療或?qū)嶒?yàn)研究時(shí)也需做純度分析和定量測(cè)定。臨床上檢測(cè)病人的抗病原生物的抗體、抗過(guò)敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對(duì)有關(guān)疾病的診斷有重要意義。
2.抗原檢測(cè)的意義可做為抗原進(jìn)行檢測(cè)的物質(zhì)可分為以下四類：
(1)各種微生物及其大分子產(chǎn)物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對(duì)菌苗、疫苗的研究。
(2)生物體內(nèi)各種大分子物質(zhì)：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補(bǔ)體的各種成分)、可溶性血型物質(zhì)、多肽類激素、細(xì)胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)這些成分的生物學(xué)作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。
(3)人和動(dòng)物細(xì)胞的表面分子：包括細(xì)胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)性情抗原等。檢測(cè)這些抗原對(duì)各種細(xì)胞的分類、分化過(guò)程及功能研究、對(duì)各種與免疫有關(guān)的疾病的診斷及發(fā)病機(jī)制的研究，均有重要意義。
(4)各種半抗原物質(zhì)：某些藥物、激素和炎癥介質(zhì)等屬于小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯(lián)到大分子的載體上，組成人工結(jié)合的完全抗原。用其免疫動(dòng)物，制備出各種半抗原的抗體，應(yīng)用于各種半抗原物質(zhì)的檢測(cè)，例如對(duì)某些病人在服用藥物后進(jìn)行血中藥物濃度的監(jiān)測(cè)。對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行服用違禁藥品的檢測(cè)，都是應(yīng)用半抗原檢測(cè)的方法。
三、抗原或抗體檢測(cè)的方法
由于各種檢測(cè)方法中所用的抗原性狀不同，出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象也不同。最廣泛應(yīng)用方法有下述幾種：
(一)沉淀反應(yīng)
可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時(shí)，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)(precipitation neaction)。
1.環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ring precipitationtest),此法簡(jiǎn)便易行，需用材料較多是其缺點(diǎn)。
2.單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(single immunodiffusion)是在凝膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴(kuò)散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物體積增加到一定程度時(shí)停止擴(kuò)散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關(guān)。本方法簡(jiǎn)便，易于觀察結(jié)果，可測(cè)定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用于定量測(cè)定人或動(dòng)物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點(diǎn)是需1～2天才能看結(jié)果
3.免疫比濁法 當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復(fù)合物，它可使通過(guò)液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強(qiáng)。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，用光散射濁度計(jì)(nephelometry)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，來(lái)推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡(jiǎn)便，可取代單向擴(kuò)散法定量測(cè)定免疫球蛋白的濃度。
4，雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 雙免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。
5.對(duì)流免疫電泳 對(duì)流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測(cè)方法，即在電場(chǎng)作用下的雙向免疫擴(kuò)散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場(chǎng)的方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動(dòng)，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時(shí)左右即可觀察結(jié)果。
6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個(gè)步驟，即先進(jìn)行電泳，再進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本�形槽，于槽內(nèi)加入含有針對(duì)各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散，可形成多答卷沉淀線。常用此法進(jìn)行血清的蛋白種類分析。對(duì)于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義
7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測(cè)。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場(chǎng)中根據(jù)分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對(duì)應(yīng)的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復(fù)合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標(biāo)記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標(biāo)記)以顯示結(jié)果
第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;
第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上;
第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上;
第四步：加入標(biāo)記的第二抗體使之覆蓋膜上;
第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現(xiàn)第二抗體
(二)凝集反應(yīng)
細(xì)菌、紅細(xì)胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆�？乖�(dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊，即稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。
1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。可用于傳染病診斷如肥達(dá)氏反應(yīng)(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細(xì)胞凝集現(xiàn)象檢查血型。
2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆�；蚣t細(xì)胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中的類風(fēng)濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測(cè)甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標(biāo)本中的抗原，如細(xì)菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集，可進(jìn)行快速診斷。故凝集反應(yīng)即可測(cè)定抗原，也可測(cè)抗體，方法簡(jiǎn)便、敏感。
3.抗球蛋白試驗(yàn) 抗球蛋白試驗(yàn)(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗(yàn)。例如應(yīng)用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時(shí)，Rh+紅細(xì)胞與抗Rh血清間的反應(yīng)。因抗Rh抗體是IgG只有兩個(gè)結(jié)合價(jià)，分子較小(不如IgM結(jié)合價(jià)多，分子大)很難直接引起Rh+紅細(xì)胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細(xì)胞。也就是經(jīng)抗Ig的作用提高凝集反應(yīng)的靈敏度。
(三)補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)
這一類反應(yīng)主要包括溶血反應(yīng)(hemolytic assay)、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)(complement mediated cytotoxicuty test)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test)。
1.溶血反應(yīng) 抗體與紅細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補(bǔ)體活化，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，此方法可用于紅細(xì)胞的各種抗原或相應(yīng)抗體的檢測(cè)，此法比凝集反應(yīng)敏感。溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細(xì)胞即空斑形成細(xì)胞(PFC)檢測(cè)的原理。
2.補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)各種有核細(xì)胞與針對(duì)其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復(fù)合物能活化反應(yīng)中的補(bǔ)體，引起細(xì)胞膜穿孔，在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞仍能維持一定的形態(tài)不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)后，染料即可進(jìn)入被活化補(bǔ)體穿孔的細(xì)胞，不帶相應(yīng)抗原細(xì)胞膜保持完整的活細(xì)胞不著色。此方法可用于帶各種抗原的細(xì)胞的檢測(cè)，如進(jìn)行細(xì)胞MHC抗原的鑒定，和進(jìn)行淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞總數(shù)或其亞類的計(jì)數(shù)。在一些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中也可用這種方法，根據(jù)需要特異地消除帶某種抗原的細(xì)胞。
3.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)當(dāng)抗原(可溶性或顆粒性)與相應(yīng)抗體結(jié)合，由于濃度低不出現(xiàn)可見反應(yīng)時(shí)，應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可檢出此抗原抗體反應(yīng)，它比凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)靈敏度高。本法包括兩個(gè)抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測(cè)系統(tǒng)由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補(bǔ)體的新鮮豚鼠血清。試驗(yàn)時(shí)試管中先加入檢測(cè)系統(tǒng)和補(bǔ)體，混合經(jīng)37℃30分鐘使抗原、抗體、補(bǔ)體形成復(fù)合物，再加入指示系統(tǒng)，如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說(shuō)明檢測(cè)系統(tǒng)中沒有相對(duì)應(yīng)的抗原抗體，補(bǔ)體是游離的指示系統(tǒng)的SRBC和抗體結(jié)合而出現(xiàn)溶血，即為反應(yīng)陰性。如不出現(xiàn)溶血，表明檢測(cè)系統(tǒng)中有抗原抗體復(fù)合物并結(jié)合補(bǔ)體，則指示系統(tǒng)無(wú)多余的補(bǔ)體作用而沒有溶血現(xiàn)象，即為陽(yáng)性。
在敏感的抗原、抗體檢測(cè)方法(如酶標(biāo)方法)出現(xiàn)之前補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)曾廣泛用于檢測(cè)各種細(xì)菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由于本試驗(yàn)影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)已被新檢測(cè)方法所代替。
四、用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原、抗體反應(yīng)
用熒光素、同位素或酶標(biāo)記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測(cè)是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測(cè)。
1.免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence techni)是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體(或抗原)與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。
(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液，細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞(如T細(xì)胞和B細(xì)胞)或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點(diǎn)是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。
(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體(不標(biāo)記熒光)結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動(dòng)物的只需制備一種抗人或動(dòng)物的免疫球蛋白熒光抗體
免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標(biāo)志，所以使用熒光標(biāo)記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。使用流式細(xì)胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞的大小、熒光強(qiáng)度。針對(duì)細(xì)胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發(fā)黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記染色。對(duì)淋巴細(xì)胞亞類鑒定起著巨大推動(dòng)作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。
2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原(或抗體)與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合，通過(guò)測(cè)定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，可用于測(cè)定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：
(1)液相法：將待檢標(biāo)本(例如含胰島素抗原)與定時(shí)的同位素標(biāo)記的胰島素(抗原)和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測(cè)定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競(jìng)爭(zhēng)奪戰(zhàn) 性與胰島素抗體結(jié)合。非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標(biāo)記抗原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量
(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)記抗體。測(cè)定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管
放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素等)維生素、藥物、IgE等。
3.酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測(cè)方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物高效催化作用結(jié)合起來(lái)，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測(cè)定儀作定量分析，敏感度可達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase)、堿性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長(zhǎng)時(shí)間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測(cè)定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原;后者主要測(cè)定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測(cè)試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。
(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行政區(qū)。可用間接法、雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原或抗體。
(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的抗原即可與載體上的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的材料后加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測(cè)儀測(cè)量顏色的光密度，可定量測(cè)定抗原。
間接法(indirecr ELISA)常用于檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標(biāo)本(可能含有相應(yīng)抗體)，再加入酶標(biāo)抗Ig的抗全(即第二抗體)，經(jīng)加底物顯色后，根據(jù)顏色的光密度計(jì)算出標(biāo)本中抗體的含量。
(3)BAS-ELISA：近年來(lái)對(duì)酶免設(shè)分析法的改進(jìn)是使用生物素-親合素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統(tǒng)進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感度�？捎脕�(lái)檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)如細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞表面抗原等。一個(gè)親合素(avidin)分子可以結(jié)合4個(gè)生物素分子(biotin)。結(jié)合非常穩(wěn)定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結(jié)合，而不影響后者的生物活性。一個(gè)抗體分子可偶聯(lián)90個(gè)生物素分子，通過(guò)生物素又可連接多個(gè)親合素。因此大提高檢測(cè)的敏感度。目前應(yīng)用生物-酶標(biāo)親合素系統(tǒng)(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過(guò)生物素標(biāo)記抗體連接免疫反應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)借助生物素化酶或酶標(biāo)親合素引入酶與底物反應(yīng)系統(tǒng)。
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