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人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序
H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種。2013年3月底，在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3人感染H7N9禽流感病例。H7N9型禽流感是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報告?zhèn)魅静”O(jiān)測報告系統(tǒng)，并且也尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀。下面是yjbys小編為大家?guī)淼娜烁腥綡7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序的知識，歡迎閱讀。
一、目的
確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規(guī)范化，降低人為不規(guī)范操作對檢測結(jié)果造成的影響，保證結(jié)果的準確性和可重復性。
二、適用范圍
醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室按照《關(guān)于醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政函〔2013〕383號)和《關(guān)于做好醫(yī)療機構(gòu)人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》(衛(wèi)發(fā)明電〔2013〕29號)有關(guān)要求，使用國家疾病預防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。
三、樣本采集、運送和保存
1、盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)�？蓪⒈�、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率。患者有下呼吸道樣本時，應(yīng)優(yōu)先采集。
2、根據(jù)試劑說明書對樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采集標準操作程序(SOP)，并組織樣本采集人員進行培訓及考核。樣本的采集應(yīng)當嚴格按照SOP進行。
3、樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關(guān)規(guī)定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應(yīng)盡快進行檢測，24小時內(nèi)能檢測的樣本可置于2～8℃暫時保存，24小時內(nèi)無法檢測的樣本則應(yīng)置于≤-70℃狀態(tài)保存。如無-70℃保存條件時，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復凍融。
4、樣本采集、處理、運輸及保存不當時，可因病毒RNA降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也可因為樣本“污染”出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
四、PCR檢測
(一)樣本處理
樣本的核酸提取應(yīng)當在樣本處理區(qū)進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應(yīng)盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴防RNA酶污染及操作不當導致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應(yīng)采用低溫冷凍離心機;在生物安全柜內(nèi)進行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內(nèi)平鋪的碎冰上。提取好的RNA應(yīng)及時用于檢測，否則應(yīng)當-70℃保存。如無-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。
(二)試劑準備
試劑準備應(yīng)當在試劑準備區(qū)進行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應(yīng)當在室溫充分復融，混勻并瞬時低速離心。反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免管內(nèi)溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)當扣蓋或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
(三)加樣
加樣應(yīng)當在樣本處理區(qū)進行。加樣時應(yīng)當使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應(yīng)管準備。
(四)PCR擴增檢測
PCR擴增檢測在擴增區(qū)進行。待檢PCR管轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)。
(五)結(jié)果分析
根據(jù)所用試劑盒說明書設(shè)置基線值(baseline)。熒光閾值(threshold)設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點為原則，且Ct值應(yīng)大于所設(shè)置的擴增循環(huán)數(shù)(或顯示為undet)。使用儀器配套軟件自動分析結(jié)果。
(六)質(zhì)量控制
檢測過程對可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性進行質(zhì)量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應(yīng)當有1份弱陽性和3份陰性質(zhì)控樣本(多份陰性質(zhì)控樣本設(shè)置對實驗室“污染”所致假陽性的監(jiān)控更為有效)，隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質(zhì)控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內(nèi)標”控制假陰性，或弱陽性質(zhì)控樣本來源困難，可暫不設(shè)弱陽性質(zhì)控。陰性質(zhì)控樣本采用標本采集管內(nèi)溶液即可。質(zhì)控樣本應(yīng)與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。
試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。
(七)實驗結(jié)果的判定與解釋。
按照試劑盒說明書進行。對于出現(xiàn)弱陽性結(jié)果的樣本應(yīng)進行重復檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結(jié)果區(qū)別。
五、檢測結(jié)果報告
按照試劑盒說明書進行。
六、其它注意事項
(一)人感染H7N9禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓并具備相應(yīng)的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施(使用眼罩、N95型口罩等)。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實驗室，經(jīng)過年檢合格的二級生物安全柜內(nèi)進行。實驗室應(yīng)具有良好的通風。
(二)注意儀器設(shè)備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設(shè)備應(yīng)進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應(yīng)管、離心管、帶濾芯吸頭等應(yīng)進行每批質(zhì)檢。
(三)實驗應(yīng)嚴格分區(qū)操作;各區(qū)物品、工作服等均應(yīng)當專區(qū)專用，不得交叉使用。實驗后應(yīng)及時清潔工作臺，以防污染。
(四)每批實驗室后，可采取實驗室通風、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染。
(五)使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應(yīng)試劑盒說明書有關(guān)要求
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