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醫(yī)藥類畢業(yè)論文
研究顯示，生長激素對人體免疫系統(tǒng)發(fā)育及調(diào)節(jié)具有重要作用,生長激素可增強機體的細胞免疫功能,促使NK細胞活性增強，使白細胞介素2(IL?2)和干擾素(IFN?γ)表達增強[1]。NK細胞是Th1類細胞，IL?2和IFN?γ是Th1類細胞因子，因此推測重組人生長激素可能促使機體免疫狀態(tài)向Th1狀態(tài)偏移。本研究以IL?2和IFN?γ代表Th1類細胞因子，白細胞介素4(IL?4)和白細胞介素10(IL?10)代表Th2類細胞因子，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT?PCR)技術(shù)檢測原發(fā)性肝癌術(shù)后短期應(yīng)用重組人生長激素后外周血單個核細胞(PBMC)Th1/Th2細胞因子的表達，探討短期應(yīng)用重組人生長激素在肝癌切除后對機體Th1/Th2偏移的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1、 資料和方法
1.1 一般資料
原發(fā)性肝癌病人36例，分為重組人生長激素組和單純手術(shù)切除組。重組人生長激素組16例，男14例，女2例;年齡38～66歲，平均52.5歲;肝細胞性肝癌10例，膽管細胞性肝癌3例，混合細胞性肝癌3例;腫瘤直徑4.4～8.2 cm; HBcAb(+)10例，HBsAg(+)10例，HBsAb(+)4例，HBeAg(+)1例，HBeAb(+)4例。單純手術(shù)切除組20例，男16例，女4例;年齡39～61歲，平均49.8歲;肝細胞性肝癌18例，膽管細胞性肝癌2例;腫瘤直徑3.3～10.3 cm;HBsAg(+)18例，HBsAb(+)2例，HBeAg(+)2例，HBeAb(+)10例，HBcAb(+)18例。
1.2 標本來源
所有病人均于術(shù)前和術(shù)后10 d采集肘靜脈血4 mL,EDTAK2抗凝。
1.3 PBMC的提取
用淋巴細胞分離液離心分層法分離提取病人血標本中的PBMC。
1.4 PBMC總RNA的提取
異硫氰酸胍法提取PBMC中的總RNA。
1.5 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物
4種細胞因子和β?actin的引物序列見表1。均由上海博亞生物工程公司合成。
1.6 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國GB?CO公司。 5～10 μg總RNA加入5×buffer 4 μL，0.1 mol/L DDT 2 μL, M?MLV 1 μL(200U), 4×dNTP(10 mmol/L,每種)1 μL，下游引物P2 (50 pmol/L)0.5 μL,總反應(yīng)體積20 μL。37 ℃作用1 h后，95 ℃ 10 min滅活M?MLV。
1.7 PCR反應(yīng)
在20 μL的RT反應(yīng)產(chǎn)物中，加入10×buffer10 μL，25 mmol/L氯化鎂8 μL， 4×dNTP 1 μL，上游引物P1(50 pmol/L)0.5 μL，液體石蠟100 μL，95 ℃下5 min，然后加入TaqDNA聚合酶(106 U/L)2 μL。循環(huán)條件：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，35個循環(huán);最后72 ℃延長7 min。
1.8 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及其圖像分析
PCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳20～30 min。紫外線燈下觀察并拍照。用美國Kodak凝膠分析系統(tǒng)檢測其吸光度(A)值作為表達強度，以β?actin為內(nèi)參照。表達強度=細胞因子A值/β?actin A值。
1.9 Th1/Th2平衡狀況的判斷
如果僅IFN?γ 和(或) IL?2表達，或者其表達強度比IL?10 和(或) IL?4的表達強度高，則為Th1狀態(tài);如果僅IL?10 和(或) IL?4表達，或者其表達強度比IFN?γ 和(或) IL?2的表達強度高，則為Th2狀態(tài)。如果4種細胞因子均未表達或表達強度一致或類似，則為Th0狀態(tài)。
1.10 統(tǒng)計學(xué)處理
采用PPMS 1.5 統(tǒng)計軟件[2]進行統(tǒng)計處理。
2、 結(jié)果
重組人生長激素組病人與單純手術(shù)切除組術(shù)前Th1、Th2表達差異均無顯著性(P>0.05)。兩組術(shù)后第10天比較，差異有顯著性(Uc=2.58，P<0.01)。見表2。
表2 兩組不同時間Th1、Th2狀況比較(例)組 別標本采取時間nTh1Th2Th0單純手術(shù)切除組術(shù)前201424術(shù)后10 d20947重組人生長激素組術(shù)前161024術(shù)后10 d161411
3、 討論
生長激素對兒童免疫功能有重要的調(diào)節(jié)作用。陳耀勇等以NK細胞、IL?1α和IL?2活性等指標，對去垂體大鼠及生長激素缺乏癥(GHD)病兒在生長激素治療前后的免疫指標進行了研究，發(fā)現(xiàn)去垂體大鼠NK細胞活性及IL?1α和IL?2活性均明顯降低，外源性生長激素可使上述指標得到不同程度的恢復(fù)。GHD病兒NK細胞活性明顯降低，經(jīng)生長激素治療3個月后恢復(fù)到正常水平， IL?1α和IL?2活性治療后有逐漸增高的趨勢。國內(nèi)楊毅等研究則顯示，兒童胸腺、 淋巴結(jié)和外周血淋巴細胞都有生長激素合成細胞，認為生長激素對于影響和調(diào)節(jié)小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育具有重要作用。 生長激素對成年人免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)也具有重要作用。正常人的胸腺和淋巴細胞上存在生長激素的結(jié)合位點，生長激素與之結(jié)合后可促進淋巴組織增生。研究顯示，生長激素能影響T細胞的功能，并促使T細胞在胸腺中發(fā)育[3]。無論外源性或內(nèi)源性生長激素均可使PHA激活的淋巴細胞IL?2R、 IL?2和IFN?γ的表達增強，抗生長激素抗體可抵消這一作用，說明生長激素對淋巴細胞的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。重組人生長激素可使危重病病人NK細胞活性增強，并提高CD4/CD8比率。由以上研究報道可以看出，重組人生長激素可增強機體的細胞免疫功能，NK細胞是Th1類細胞，IL?2和IFN?γ是Th1類細胞因子，因此，重組人生長激素可能促使機體向Th1狀態(tài)偏移。
以前的研究都未明確生長激素抗腫瘤作用的機制。自輔助性T細胞Th1/Th2亞群概念提出以來，人們對其在機體免疫反應(yīng)中的作用進行了大量的研究。正常機體的Th1/Th2類細胞因子處于動態(tài)平衡，當(dāng)這個平衡失衡并向Th1狀態(tài)或Th2狀態(tài)轉(zhuǎn)化時，稱為Th1/Th2的偏移。病理狀態(tài)下，如外傷、手術(shù)、感染和腫瘤等，均存在向Th2狀態(tài)的偏移， Th2類細胞因子優(yōu)勢狀態(tài)不利于創(chuàng)傷恢復(fù)和抗腫瘤免疫。細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要方式。IFN?γ、 IL?2和TNF?β等細胞因子在機體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，IL?2可刺激NK細胞和CTL細胞的殺瘤活性，而IFN?γ有較強的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，TNF?β可直接造成腫瘤細胞凋亡。以上細胞因子由Th1類細胞直接分泌，因此機體要處于良好的抗腫瘤狀態(tài)，Th1類細胞應(yīng)占優(yōu)勢。本實驗結(jié)果表明，術(shù)后重組人生長激素組比單純手術(shù)切除組Th1類細胞因子表達明顯增高，差異有顯著性。這說明肝癌病人腫瘤切除后重組人生長激素應(yīng)用后可促使Th1類細胞因子表達，使Th1/Th2偏向Th1狀態(tài)，有利于腫瘤的治療。
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