番木瓜eIF4E和eIFiso4E的克隆及其與PRSV-VPg互作研究

　　論文摘要: 番木瓜環(huán)斑病毒(Papaya Ringspot Virus, PRSV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvir（略）是制約番木瓜種植業(yè)和加工產(chǎn)業(yè)的主要因素.在馬鈴薯Y病毒基因組5’端（略）因組連接蛋白(virus genome-linked protein, VPg), VPg可在病毒的感染周期中干預(yù)幾個(gè)步驟,包括病毒RNA的復(fù)制,病毒細(xì)胞間移動(dòng)和長距離移動(dòng).真核翻譯起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)能夠與mRNA的帽子結(jié)構(gòu)或帽子同系物特異地交（略）白質(zhì)合成的起始中起關(guān)鍵作用.通常情況下,mRNA是通過5’帽子結(jié)構(gòu)與eIF4E結(jié)合,但馬鈴薯Y病毒屬病毒基因組的5’端沒有帽子結(jié)構(gòu),而是共價(jià)結(jié)合VPg蛋白.研究發(fā)現(xiàn),病毒基因組連（略）與eIF4E的結(jié)合在多種馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染植物過程中起關(guān)鍵作用,通過突變eIF4E的關(guān)鍵位點(diǎn)能影響病毒-植物的互作,并能介導(dǎo)植物對病毒的抗性.eIF4E是一個(gè)多（略）植物中eIF4E家族成員包括eIF4E及其異構(gòu)體eIFiso4E,這兩個(gè)因子在翻譯起始過程的作用...

　　The potyvirus papaya ringspot virus (PRSV) is an important pathogen that restricts papay（omitted）ion and cucurbits production. At the 5end of the potyvirus genome, there is a viral（omitted）inked to the genome (VPg) which m（omitted）ne at several steps in the virus infection cycle, including viral RNA replication, and viral cell-to-cell and long-distance movement.（omitted）otic translation initiation factor 4（omitted）n bind with m7GpppN cap structure of mRNA or cap homologue specifically play impor...

　　目錄:摘要 第4-6頁

　　Abstract 第6-7頁

　　目錄 第8-12頁

　　1. 引言 第12-27頁

　　·番木瓜環(huán)斑病毒概述 第13-16頁

　　·癥狀表現(xiàn) 第13頁

　　·PRSV株系、寄主范圍和傳播途徑 第13-14頁

　　·馬鈴薯Y病毒屬基因組結(jié)構(gòu)和功能研究 第14頁

　　·番木瓜抗PRSV基因工程研究 第14-16頁

　　·真核翻譯起始因子4E的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)節(jié) 第16-17頁

　　·真核翻譯起始因子4E的結(jié)構(gòu) 第16頁

　　·真核翻譯起始因子4E的功能 第16頁

　　·真核翻譯起始因子4E的調(diào)節(jié) 第16-17頁

　　·植物真核翻譯起始因子4E的研究進(jìn)展 第17-22頁

　　·真核翻譯起始因子4E與蛋白質(zhì)翻譯起始 第17-18頁

　　·eIF4E參與馬鈴薯Y病毒繁殖的可能機(jī)制 第18-19頁

　　·馬鈴薯Y病毒可選擇性地利用eIF4E基因家族的成員 第19-20頁

　　·植物eIF4E與病毒互作的研究 第20頁

　　·eIF4E在植物抗病上的研究 第20-22頁

　　·本文研究蛋白質(zhì)相互作用的方法 第22-24頁

　　·細(xì)胞核酵母雙雜交 第22-23頁

　　·雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù) 第23-24頁

　　·本研究的目的意義和技術(shù)路線 第24-27頁

　　·目的意義 第24-26頁

　　·技術(shù)路線 第26-27頁

　　2 材料與方法 第27-51頁

　　·材料與試劑 第27-33頁

　　·植物材料 第27頁

　　·主要的酶和生化試劑 第27頁

　　·菌株和質(zhì)粒 第27-28頁

　　·表達(dá)載體及克隆載體圖 第28-30頁

　　·培養(yǎng)基 第30-33頁

　　·主要儀器設(shè)備 第33頁

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 第33-39頁

　　·番木瓜RNA提取 第33-34頁

　　·試驗(yàn)器材的處理 第33-34頁

　　·從組織中提取總RNA 第34頁

　　·雙鏈cDNA合成 第34-35頁

　　·引物設(shè)計(jì)和RT-PCR反應(yīng) 第35-36頁

　　·PCR擴(kuò)增程序 第36頁

　　·PCR產(chǎn)物回收與鑒定 第36-39頁

　　·PCR產(chǎn)物回收 第36-37頁

　　·PCR回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T Vector的連接 第37頁

　　·大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法) 第37-38頁

　　·連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 第38頁

　　·重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定 第38頁

　　·序列鑒定與分析 第38-39頁

　　·酵母雙雜交鑒定PRSV-VPg與番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 第39-47頁

　　·酵母誘餌表達(dá)載體pBD-GAL4 Cam-VPg的構(gòu)建及鑒定 第39-41頁

　　·VPg基因加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn) 第39頁

　　·重組質(zhì)粒的提取(采用TIANGEN小提中量試劑盒) 第39-40頁

　　·重組質(zhì)粒的酶切鑒定 第40頁

　　·誘餌載體pBD-GAL4 Cam的制備 第40頁

　　·VPg基因與誘餌載體pBD-GALA-Cam的連接 第40-41頁

　　·連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定 第41頁

　　·酵母激活域表達(dá)載體pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E的構(gòu)建及鑒定 第41-42頁

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn) 第41-42頁

　　·重組質(zhì)粒的提取 第42頁

　　·重組質(zhì)粒的酶切鑒定 第42頁

　　·激活域載體pAD-GAL4-2.1的制備 第42頁

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因與激活域載體pAD-GAL4-Cam的連接 第42頁

　　·連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定 第42頁

　　·誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及毒性與自激活檢測 第42-44頁

　　·酵母菌株表型鑒定及酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 第43頁

　　·酵母菌株表型鑒定 第43頁

　　·酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 第43頁

　　·分別轉(zhuǎn)化重組子pBD-GAL4 Cam-VPg和空載體pBD-GAL4 Cam(對照)入酵母YRG-2感受態(tài) 第43-44頁

　　·誘餌表達(dá)質(zhì)粒的毒性檢測 第44頁

　　·誘餌質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白自激活檢測 第44頁

　　·激活域載體轉(zhuǎn)化酵母YRG-2及毒性與自激活檢測 第44-45頁

　　·酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 第44-45頁

　　·分別轉(zhuǎn)化重組子pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E、空載體pAD-GAL4-2.1(陰性對照)及pGAL4(陽性對照)入酵母YRG-2感受態(tài) 第45頁

　　·激活域表達(dá)質(zhì)粒的毒性檢測 第45頁

　　·激活域表達(dá)質(zhì)粒自激活檢測 第45頁

　　·酵母雙雜交 第45-46頁

　　·含有誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 第45頁

　　·轉(zhuǎn)化激活域重組子入含有誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞 第45-46頁

　　·酵母克隆的初步鑒定 第46-47頁

　　·β-半乳糖苷酶影印法篩選陽性克隆 第46頁

　　·陽性酵母質(zhì)粒的提取、回轉(zhuǎn)大腸桿菌驗(yàn)證 第46-47頁

　　·陽性克隆的測序 第47頁

　　·雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證鑒定PRSV-VPg與番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 第47-51頁

　　·BiFc載體的構(gòu)建 第47-50頁

　　·添加酶切位點(diǎn) 第47-48頁

　　·酶切反應(yīng)體系 第48-49頁

　　·BiFc表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 第49-50頁

　　·重組質(zhì)粒的大量提取(利用TIANGEN的高純度大提試劑盒) 第50頁

　　·基因槍轉(zhuǎn)化 第50-51頁

　　·金粉的處理 第50頁

　　·基因槍的子彈制備 第50-51頁

　　·轟擊 第51頁

　　·洋蔥表皮預(yù)處理 第51頁

　　·熒光顯微鏡下觀察 第51頁

　　3 結(jié)果與分析 第51-64頁

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 第51-56頁

　　·番木瓜果實(shí)總RNA的提取 第51-52頁

　　·番木瓜eIF4E基因全長序列的克隆 第52-53頁

　　·番木瓜eIFiso4E基因全長序列的克隆 第53頁

　　·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E結(jié)構(gòu)分析 第53-56頁

　　·酵母雙雜交互作結(jié)果 第56-60頁

　　·酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 第56-58頁

　　·酶切位點(diǎn)引入PRSV-VPg、Cp-eIF4E及Cp-eIFiso4E 第56-57頁

　　·誘餌載體和激活域載體的構(gòu)建和鑒定 第57-58頁

　　·酵母菌株YRG-2表型鑒定 第58頁

　　·誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母YRG-2毒性及自激活檢測 第58頁

　　·激活域載體轉(zhuǎn)化酵母YRG-2毒性及自激活檢測 第58-59頁

　　·酵母雙雜交篩選結(jié)果 第59-60頁

　　·營養(yǎng)缺陷型篩選及LacZ活性篩選 第59-60頁

　　·回轉(zhuǎn)驗(yàn)證及測序 第60頁

　　·雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證PRSV-VPg與Cp-EIF4E和Cp-eIFiso4E的互作結(jié)果 第60-64頁

　　·BiFc載體的構(gòu)建與鑒定 第60-62頁

　　·基因槍轉(zhuǎn)化結(jié)果 第62-64頁

　　4 討論 第64-67頁

　　·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上與mRNA帽子及4G作用的活性部位氨基酸與其它eIF4E和eIFiso4E的高度保守 第64頁

　　·已知抗病位點(diǎn)在Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上的定位 第64-65頁

　　·馬鈴薯Y病毒VPg利用植物eIF4E及eIFiso4E的情況 第65頁

　　·GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)和BIFC同時(shí)研究PRSV-VPg與CP-eIF4E和CP-eIFiso4E的互作情況 第65-66頁

　　·以番木瓜eIF4E為靶點(diǎn)抗PRSV的可行性 第66-67頁

　　5 主要結(jié)論及進(jìn)一步研究建議 第67頁

　　·主要結(jié)論 第67頁

　　·進(jìn)一步研究建議 第67頁

　　參考文獻(xiàn) 第67-75頁

　　附錄 第75-76頁

　　致謝 第76頁

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