焦?fàn)t工血清p53蛋白的檢測分析

【摘要】  目的 探討職業(yè)接觸焦?fàn)t逸散物的焦?fàn)t工人血清p53蛋白的表達(dá)水平及其在肺癌高危人群篩檢中的意義。方法 運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Westernblot），對接觸組118例和對照組50例人群的血清p53蛋白進(jìn)行檢測，比較兩組血清p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 接觸組不同工齡組、不同作業(yè)地點(diǎn)間p53蛋白的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0?05）。結(jié)論 經(jīng)常大量接觸焦?fàn)t逸散物可使p53蛋白的表達(dá)水平升高，增加p53基因異常的危險性，從而使焦?fàn)t工患肺癌的危險性增加。 
【關(guān)鍵詞】  焦?fàn)t逸散物；蛋白免疫印跡；p53蛋白
     【Abstract】 Objective Serum p53 protein overexpression was detect in coke oven workers to explore the biomarker of early diagnosis of lung cancer.Methods Western blot was used for determing the level of p53.Serum p53 were compared between two groups. Results Compared with the control group, p53 levels in the different exposed group and different operating points increased significantly（P<0?05）,and the expression of p53 increased gradually in the exposed group with years of service. Conclusion The results suggested that coking oven emissions (COE) were likely to cause mutation of p53 gene and increasing the incidence of lung cancer.
    【Key words】 coking oven emissions (COE)， Westernblot， p53 protein
    尋找和確定合適的早期監(jiān)測指標(biāo)一直是職業(yè)性腫瘤高危人群篩檢的重要研究課題。新近發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53與職業(yè)性肺癌密切相關(guān)，其改變可發(fā)生在癌變的早期階段，并于血清中出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物［１］。多環(huán)芳烴職業(yè)接觸者是肺癌發(fā)生的高危人群。本調(diào)查采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblot)檢測多環(huán)芳烴職業(yè)接觸者——焦?fàn)t工血清p53蛋白的表達(dá)情況，以探討血清p53蛋白作為焦?fàn)t工早期篩查肺癌指標(biāo)的意義。
    1 對象與方法
    1.1 研究對象 將某有限公司焦化廠煉焦車間的2004年3月在冊職工（均為男性），按工齡分為3層，即﹤10年、10年～、20年～，再以等比例抽樣法在各層抽取31、53、34人，共118人，組成接觸組。對照組選自工作地點(diǎn)距該焦化廠3 000 m以外，且在3個月內(nèi)未去過焦化廠的工廠男性醫(yī)務(wù)人員50名組成對照，均未曾有任何職業(yè)致癌物接觸史。
    1.2 樣本收集與處理 于清晨空腹采集每位調(diào)查對象的肘靜脈血2 ml，不抗凝，2 000 r/min常溫離心30 min，吸取血清至1.5 ml干凈離心管中，并采用雙縮脲法測定血清樣品的總蛋白濃度，用雙蒸水將樣品濃度調(diào)至3.5 mg/ml，-20℃保存待測。
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法 Westernblot方法檢測血清p53蛋白,按文獻(xiàn)［２］的方法對p53進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)? Ｆ渲幸豢褂猛每谷藀53多克隆抗體(0?5%Tris飽和鹽水（TBS）按1∶500稀釋，美國Santa Cruz公司)， TBS中洗膜5 min×3次。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(0.5% TBS按1∶400稀釋，美國Sigma)， TBS中洗膜5 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 min，大量雙蒸水清洗3次終止顯色。結(jié)果掃描保存，并用捷達(dá)801系列凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)分析p53蛋白水平 (單位:積分吸光度)。
    1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對實(shí)驗(yàn)室結(jié)果經(jīng)核實(shí)確系無誤后建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS10?0統(tǒng)計(jì)軟件對焦?fàn)t工不同工齡組間、不同作業(yè)地點(diǎn)的p53蛋白表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析。
    2 結(jié)果
    2.1 研究對象的均衡性 118名焦?fàn)t工的平均年齡為（36.28±7.90）歲，50名對照組的平均年齡為（37?04±9?74）歲，接觸組和對照組工人均為漢族；兩組在年齡,經(jīng)濟(jì)水平分布上無顯著性差異（t值分別為-0?528、1?637，P﹥0?05）,文化程度構(gòu)成差異無顯著性（χ2=2?633，P﹥0?05），可見兩組均衡性較好。
    2.2 生產(chǎn)環(huán)境空氣中有毒物質(zhì)檢測結(jié)果 作業(yè)場所環(huán)境監(jiān)測結(jié)果見表1 ，各測定地點(diǎn)粉塵和B［a］P濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以爐頂為最高。表1 焦?fàn)t作業(yè)區(qū)不同地點(diǎn)空氣B［a］P、粉塵濃度
    2.3.1 血清蛋白經(jīng)SDS?PAGE電泳，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)R250染色，按10 μl/道加樣，蛋白量約為35 μg ，接觸組在條帶上明顯高于對照組，見圖1。Westernblot分析結(jié)果，根據(jù)與預(yù)染蛋白Marker分子量的比較，在62 kD和48 kD之間有單一條帶即為p53。
    2.3.2 不同工齡組與對照組血清p53表達(dá)水平比較：經(jīng)檢驗(yàn)，接觸組與對照組p53蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0?05），見表2。表2 不同工齡組與對照組血清p53平均水平比較

    2.3.3 不同作業(yè)地點(diǎn)與對照組血清p53表達(dá)水平比較：作業(yè)區(qū)不同地點(diǎn)的p53蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組（P﹤0?05），其中，爐頂?shù)膒53蛋白的表達(dá)水平高于機(jī)側(cè) （P﹤0?05），其余各地點(diǎn)間差異無顯著性，見表3。表3 不同地點(diǎn)與對照組血清p53平均水平比
    3 討論
    Alian［３］的研究認(rèn)為p53基因是環(huán)境和職業(yè)致癌作用的靶基因。COE的主要成分是多環(huán)芳烴化合物（PAHs），PAHs的主要致癌成分為苯并［ａ］芘，其最終活性產(chǎn)物能在p53基因的突變熱點(diǎn)區(qū)域與DNA形成加合物，造成p53基因突變。如果p53基因發(fā)生突變，它所表達(dá)的p53蛋白的穩(wěn)定性就會增加，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生堆積，分泌到血液中，出現(xiàn)過量表達(dá)。由于p53蛋白可以分泌到血液中，所以檢測血清p53蛋白可以反映體內(nèi)p53基因表達(dá)的情況［４］，提示機(jī)體發(fā)生腫瘤可能性的大? ６苑偉└呶Ｈ巳旱難芯勘礱鰨?恍┚?＝喲ブ擄┪锏鬧耙等巳海?緗喲ナ?蕖⒘で唷⒏醯墓と搜?錺53蛋白的過表達(dá)率要高于對照組非暴露人群［５］。煉焦工齡常是決定發(fā)病的重要因素，此次調(diào)查在不同工齡組p53的表達(dá)水平有顯著性差異，隨著工齡的增加，p53的表達(dá)量增加；不同作業(yè)地點(diǎn)p53的表達(dá)水平不同，爐頂工明顯高于機(jī)側(cè)工，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0?05），工齡和作業(yè)地點(diǎn)兩方面結(jié)果反映了長期暴露于含有高濃度多環(huán)芳烴的作業(yè)環(huán)境,大量苯并［ａ］芘反復(fù)持續(xù)進(jìn)入體內(nèi),造成組織細(xì)胞p53基因損傷,表現(xiàn)為部分暴露者血清p53蛋白水平異常增高。p53作為抑癌基因，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞增殖過程中的過量表達(dá)，可作為肺癌高危人群的篩檢指標(biāo)，用于焦?fàn)t工職業(yè)病體檢中，有利于焦?fàn)t工的健康監(jiān)護(hù)，為煤焦瀝青作業(yè)者的勞動保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。
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