組織芯片的手工制作技術及其應用
作者：朱玉紅 呂增華 張祥盛【關鍵詞】 手工組織芯片；芯片；HE染色；免疫組化染色
組織芯片又稱組織微陣列，是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至數(shù)千個小的組織片整齊地排列在某一載體上（通常是載玻片）而成的微縮組織切片［1］。該切片體積小，信息含量大，可以進行HE染色、特殊染色、免疫組織化學染色和原位雜交等，一次實驗即可獲得大量信息，大大節(jié)約了組織原材料和檢測試劑，減少了實驗誤差，增強了可比性，操作簡便［2］。但組織芯片制作技術一般采用進口的組織微陣列儀或組織芯片制作機，這些儀器價格昂貴，不適于基層單位使用。為此我們嘗試手工方法制作組織芯片，并取得了較好的效果�，F(xiàn)介紹如下。
1 材料與方法
1?1 標本來源 收集2004年1月—2005年10月間我院胸外科送檢的肺腫瘤組織石蠟標本106例，其中腺癌36例，鱗癌30例，小細胞癌30例，瘤旁正常肺組織10例。
1?2 方法
1?2?1 組織處理：所有標本經4%的甲醛固定，正常組織處理，石蠟包埋，并常規(guī)切片HE染色。
1?2?2 組織芯片的基本制作過程：①自制打孔針和取樣針：60 ml注射器針頭2個，其內徑為1.5 mm，分別用于打孔和穿取組織。介入治療科用穿刺針1個，其內徑1?4 mm 。用鋸片將3個針末端的針尖鋸成平端，且使穿刺針比注射器針略長1~2 mm并將其末端磨圓，便于鉆取蠟塊后將注射器針內的蠟芯完整推出。②收集和選擇病例：首先應根據(jù)已有研究課題收集和選擇病例。復查組織切片，審查病理診斷，標記組織中的靶點(即欲取組織點)并在切片上面畫圈標記。選擇相應組織蠟塊(稱為供體蠟塊donor)標記相應靶點并畫圈。③受體蠟塊的制作：將56~58℃石蠟(上海華靈公司產品)經多次反復溶化后過濾，注入模具內，制成空白蠟塊，選用模具大小可根據(jù)打孔的多少而定。打孔前先用載玻片在受體蠟塊表面劃定界限，根據(jù)樣本多少決定打孔數(shù)目和區(qū)域，并用直尺劃出網格線。④組織蠟芯的獲得與植入：將供體蠟塊組織面朝下放入45℃恒溫水浴鍋中1 min，組織塊受熱不僅易于鉆取且不會破壞其周圍組織，最大程度減少對供體蠟塊的破壞，用另一打洞針在蠟塊的標記部位打洞采集組織芯。組織芯推出后，直接插入或用鑷子小心夾取插入受體蠟塊的空洞內。有時因為標本的原因，鉆取的組織蠟芯僅部分有組織、部分為空白時，可以在毗鄰處重復鉆取，切除空白部分，將前半截有組織蠟芯裝入孔內，用穿刺針針芯送入底部后再裝入另一個有組織的半截蠟芯，并用針芯適當填搗，兩截間不留間隙，以保證切片時每一孔標本都能切到。⑤組織芯片的表面平整：在微陣列排好以后，可以發(fā)現(xiàn)樣本高低不平，此時可以將受體石蠟塊放在60 ℃的烤箱中10~15 min，然后用一個載玻片下壓平整，注意要均勻下壓［3］。⑥ 受體蠟塊與組織蠟芯的融合：將做好的蠟塊有組織的一面朝下放入模具內，置入60 ℃烤箱內1 h，使兩者重新溶為一體，在這個過程中，每10 min觀察一次，既要保證組織芯和蠟融合在一起，又要防止TMA蠟塊完全溶解、組織排列混亂而無法使用。組織芯和蠟融合好后輕輕地從烤箱中取出模具,讓半融狀態(tài)的石蠟在室溫條件下冷卻約30 min，再放入冰箱冷凍后,將組織芯片蠟塊從模具中取出，至此，組織芯片蠟塊便制做成功。⑦切片 ：修正蠟塊，用冰塊冰組織面，連續(xù)5 μm厚切片，40 ℃溫控漂烘儀裱片，用于免疫組化染色的組織切片裱于經多聚賴氨酸溶液處理的載玻片上，56 ℃烤片3 h后移至37 ℃恒溫箱中過夜。
1?2?3 免疫組織化學染色：對已制作好的組織芯片進行免疫組織化學染色，采用即用型ElivisionTM plus法，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)高壓煮沸抗原修復，PBS緩沖液沖洗，一抗4℃冰箱過夜。DAB顯色，蘇木素復染，選用的抗體有MMP?9、Ki67、PCNA、CD147、VEGF等。以上試劑均由福州邁新生物技術開發(fā)公司提供。
2 結果
2?1 組織芯片的質量 本實驗2個組織芯蠟塊共切片10張，載玻片上組織陣列整齊，530個微組織塊有8塊脫失，3塊組織有部分折疊，其余組織形態(tài)保存完好。
2?2 免疫組織化學染色 Ki67、PCNA陽性反應呈棕黃色，定位于細胞核上；MMP?9、CD147、VEGF陽性反應定位于細胞漿，顯色清晰，背景干凈。3 討論
組織芯片容納的信息量大，一張玻片可排列數(shù)十到上千個樣本，一次完成實驗，既省時、省力、節(jié)約試劑，又減少了實驗誤差，增加了結果的準確性、可比性和可靠性。我們用手工方法制作組織芯片，只需60 ml注射器針頭和介入治療科廢舊穿刺針，工具簡單，適于在基層院應用。 組織芯片制作過程中最常見的現(xiàn)象是目標蠟塊損壞、無效組織、組織缺失、折疊、移位和飄散。為此，應注意以下幾個問題：①對目標蠟塊的保護：在微陣列蠟塊的制作中，由于要從目標蠟塊中鉆取組織，在鉆取中不可用力過猛，應當勻速鉆取，也可以把蠟塊放入45~50 ℃的熱水中浸泡數(shù)秒鐘再鉆取目標組織,這樣可防止損傷組織，鉆取組織結束后,為了保護蠟塊可將鉆孔用蠟密封。②用針直接在冷卻后的蠟塊上打孔不容易成功，因為很容易使蠟塊碎裂或造成相鄰孔的貫通。實踐中我們發(fā)現(xiàn)對于熔點為58 ℃的石蠟，置于45 ℃的恒溫水浴鍋內2 min左右，在蠟塊微微變軟時打孔效果好。③供體蠟塊的厚度及其制作過程直接影響到芯片的質量。由于存檔蠟塊經反復使用，組織厚薄不一，組織芯易出現(xiàn)漏取或深淺不一，另存檔蠟塊的制作不盡相同，質量參差不齊，從而降低了組織芯片的利用率。所以在平時工作中應嚴格按照操作指南進行，臨床組織標本的制作或針對組織芯片構建的需要，專門留取相應組織，將組織取材為1.5 cm×1.0 cm×0.4 cm，手工脫水、透明、包埋,保證供體蠟塊的質量。④無效組織的處理：所謂無效組織包括以下兩種：一是指在目標蠟塊中定位不準確，未取到目標組織。避免的辦法是病理診斷醫(yī)師負責切片的診斷，準確找出所需區(qū)域并作出相應標記；病理技術人員熟練掌握芯片制作方法，病理診斷醫(yī)師與病理技術人員密切合作是避免無效組織的關鍵。二是組織厚度不夠，在HE切片下有所需組織，但由于組織太薄，再修整后已沒有所需組織，避免的辦法是盡可能選擇組織塊較厚的蠟塊，或針對組織芯片構建的需要，取材時留取相應組織。⑤組織切片時，為減少多次修塊而造成的組織損耗和浪費，要一次多切片直至將組織切完。5 μm厚的芯片，可一次切片100~200張，切片可保存于-20℃~-40℃冰箱中備用。如需較長時間保存，則可用少量融化的石蠟滴封每張切片后-20℃保存，染色時可適當延長脫蠟時間，18個月內未見對免疫組化或原位雜交結果有任何負面影響［4］。⑥漂片時可將切片先漂在涼水中，讓其自然展開，然后轉移至45 ℃溫水中漂片，再貼于涂有多聚賴氨酸的玻片上。漂片水溫要適宜，溫度過高組織片易離散，溫度過低則難以保證組織片的充分展開。文獻報道的膠帶粘貼紫外線轉移法可以有效地避免組織移位和脫落［5］，但該方法膠帶從玻片上分離時很困難，同時常常會帶一部分組織下來，價格昂貴又費時，不適用于基層醫(yī)院。⑦因考慮到一些細胞尤其是腫瘤細胞的異質性問題，為使挖取組織塊能更全面的代表原組織蠟塊的結構，并保持組織完整性，我們采取了直徑1.5 mm組織樣本，理論上可包含4 000~20 000個細胞，足以反映原組織結構的信息。本實驗我們嘗試將組織芯片技術應用在免疫組織化學染色上，將106例肺組織標本做成2個組織芯蠟塊，通過一次免疫組織化學染色即完成。充分體現(xiàn)了其高效、快速、低消耗、實驗誤差小和可比性強的特點。總之，組織芯片技術還處在不斷完善的過程中，在實際工作中我們要不斷的總結經驗，改進制作技術，將組織標本的消耗降到最低，從而提高組織芯片的利用率，拓寬組織芯片的應用范圍。
【參考文獻】
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［2］ 朱明華.組織微陣列及其在腫瘤病理研究中的應用［J］.中華病理學雜志,2002,31:72?73.
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�。�5］ 倪燦榮，李芳梅，朱明華，等.提高組織芯片切片成功率的方法和體會［J］.中華病理學雜志,2002,31:559?560.
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