石蠟切片中BCL┐6抗原失活機(jī)制及修復(fù)
作者：張永清 黃高升日 趙一嶺 王哲 閆慶國(guó) 郭英【關(guān)鍵詞】 抗原修復(fù)
關(guān)鍵詞: 抗原修復(fù);免疫組織化學(xué);BCL-6;淋巴組織增生
摘 要:目的 探討石蠟切片中BCL-6抗原失活機(jī)制及修復(fù)的最佳方法. 方法 淋巴組織反應(yīng)性增生11例石蠟切片分別用二乙胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種與鈣離子結(jié)合力不同的修復(fù)液，結(jié)合高壓、微波和煮沸3種不同方法修復(fù)后，比較檢出的BCL-6陽(yáng)性率及強(qiáng)度. 結(jié)果 BCL-6陽(yáng)性率由高至低依次為:EDTA0.73>檸檬酸0.45（P<0.01）>碳酸鈉0.12（P<0.01），去離子水組無(wú)1例陽(yáng)性.高壓修復(fù)陽(yáng)性率0.55>微波修復(fù)0.28和煮沸修復(fù)0.12（P<0.05）.不同修復(fù)液與高壓結(jié)合修復(fù)檢出BCL-6陽(yáng)性率及強(qiáng)度:EDTA與檸檬酸陽(yáng)性率分別為1，0.82（P>0.05），高于碳酸鈉組（0.36）和去離子水組（0）（P<0.01）.EDTA組強(qiáng)陽(yáng)性占0.82，顯著高于其他各組（P<0.01）. 結(jié)論 EDTA結(jié)合高壓是修復(fù)BCL-6抗原的理想方法，鈣離子的參與可能是甲醛固定后BCL-6抗原失活的原因之一.
Keywords:antigen retrieval;immunohistochemistry;BCL-6;lymphoproliferation
Abstract:AIM To study the ideal method of retrieving the antigenic activity of BCL-6in paraffin sections and the possible mechanism of the antigen masking.METHODS Paraffin-embedded sections from11cases of lymphoid reac-tive hyperplasia were retrieved respectively by four retrieving solutions with different combining power with calcium:ED-TA，citrate，sodium carbonate（SC）and deionized water（DW），which with different retrieval methods:high pressure（HP），microwaving（MW）and stove boiling（SB），and the antigenic activities were detected by immunohistochemistry.RESULTS The positive percentage in sections retrieved by EDTA，citrate and SC were0.73，0.45and0.12respective-ly.The difference among the groups was significant（P<0.01）;the group of DW showed all negative.0.55of HP group was positive，which was higher than0.28of MW group and0.15of SB group（P<0.05and P<0.01）.The positive incidences of sections retrieved by HP with EDTA and HP with citrate were1and0.82respectively，which were higher than HP with SC（0.36）and HP with DW（0）（P<0.01）.0.82of HP with EDTA was intensive positive，the difference in positive intensity between HP with EDTA group and above mentioned groups was significant（P<0.01）.CONCLUSION HP with EDTA is the ideal method for retrieving antigenic activity of BCL-6by formalin-fixa-tive，suggesting that calcium may be involved in the antigen masking.
0 引言
BCL-6是位于染色體3q27原癌基因bcl-6編碼的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，由706個(gè)氨基酸組成，主要表達(dá)于淋巴組織生發(fā)中心B細(xì)胞及部分T細(xì)胞［1］ .研究證實(shí)，bcl-6剔除鼠不能形成生發(fā)中心［2］ ，其基因調(diào)控區(qū)發(fā)生易位或（和）突變與B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生有關(guān)［3，4］ ，BCL-6表達(dá)失調(diào)可引起細(xì)胞凋亡及彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生［5，6］ .檢測(cè)BCL-6表達(dá)有助于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷［7］ .然而，40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原不經(jīng)修復(fù)極難檢出.我們用免疫組化方法比較一組反應(yīng)性增生淋巴組織石蠟切片，分別用EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復(fù)機(jī)制不同的修復(fù)液，結(jié)合高壓、微波及煮沸3種常用方法的修復(fù)效果，探討B(tài)CL-6抗原失活機(jī)制及修復(fù)的理想方法.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 標(biāo)本來(lái)源及處理 2000-02/2000-06收集西京醫(yī)院病理科扁桃體炎標(biāo)本7例，反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標(biāo)本4例.經(jīng)40g・L-1 甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，切片置60℃烤箱過(guò)夜（切片用APES膠預(yù)處理）.
1.1.2 修復(fù)液及配制 1mmol・L-1 pH8.0ED-TA溶液:0.37g EDTA溶于1L蒸餾水，調(diào)pH值至8.0;10mmol・L-1 ，pH6.0檸檬酸鹽溶液、1.5mmol・L-1 pH8.0碳酸鈉溶液分別參照Cattoretti等［9］ 及Morgan等［8］ 的方法配制;去離子水用美國(guó)Millipore公司制純水器生產(chǎn).
1.2 方法 高壓修復(fù)參照Norton等［10］ 方法:1.5L修復(fù)液入壓力鍋中，加熱至沸騰.將脫蠟至水切片置于金屬架上，浸入鍋內(nèi)修復(fù)液中，蓋壓力鍋閥，加熱至壓力鍋噴氣后1min，停止加熱，冷水浸至室溫.微波修復(fù)參照Cattoretti等［9］ 方法:將脫蠟至水切片放入盛有修復(fù)液的染缸中，置醫(yī)用微波爐內(nèi)中低檔加熱10min，取出冷卻至室溫.煮沸修復(fù)法:將脫蠟至水切片浸入盛修復(fù)液的燒杯中，燒杯置于盛有自來(lái)水的鋁鍋內(nèi)，電爐上加熱，燒杯中溫度達(dá)97℃后開(kāi)始計(jì)時(shí)，15min后停止加熱，冷至室溫.
1.3 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判斷 BCL-6mAb購(gòu)自英國(guó)Novocastra公司，工作濃度1∶20.EnVisionTM 及催化信號(hào)擴(kuò)增（catalyzed signal amplification，CSA）免疫組化試劑盒購(gòu)自Dako公司，按說(shuō)明操作.11份標(biāo)本各切片13張，分13組.其中一組不修復(fù)，用CSA試劑盒檢測(cè).另12組用不同的修復(fù)液及修復(fù)方法修復(fù)，運(yùn)用Dako EnVisionTM 兩步法檢測(cè).TBS替代一抗作陰性對(duì)照.陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)價(jià)采用半定量方法，陰性不著色（-），淡黃色為陽(yáng)性（+），棕黃色顆�；驁F(tuán)塊為強(qiáng)陽(yáng)性（）（著色部位位于胞核）.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用χ2 檢驗(yàn).
2 結(jié)果
2.1 未經(jīng)修復(fù)組檢測(cè)結(jié)果 用CSA試劑盒檢測(cè)未修復(fù)組，抗BCL-6免疫組化染色均為陰性（Fig1）. 2.2 不同方法修復(fù)后BCL┐6檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復(fù)液，分別用高壓、微波及煮沸3種修復(fù)方法處理后，EDTA組陽(yáng)性率顯著高于檸檬酸組（P<0.01），后者又高于碳酸鈉組 和去離子水組（P<0.01）.3種修復(fù)方法比較，高壓修復(fù)陽(yáng)性率高于微波修復(fù)組（P<0.05）和煮沸組（P<0.01）.且高壓修復(fù)無(wú)組織脫片現(xiàn)象，其他修復(fù)方法均有不同程度的脫片（Tab1）.圖1 － 圖2 略
表1 不同方法修復(fù)后BCL-6檢測(cè)結(jié)果 略
2.3 高壓配合不同修復(fù)液的修復(fù)效果 EDTA或檸檬酸結(jié)合高壓修復(fù)方法，檢出BCL-6陽(yáng)性率分別為100%和81%（P>0.05），顯著高于碳酸鈉組及去離子水組（Tab2，P<0.01）.EDTA組11例陽(yáng)性中有9例為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（Fig2），高于其他各組（P<0.01，Tab2）.
3 討論
用靈敏度50余倍標(biāo)準(zhǔn)LSAB（labeled strepta-vidin biotin）的CSA試劑盒（見(jiàn)說(shuō)明書）檢測(cè)未經(jīng)修復(fù)的11例石蠟切片，結(jié)果全為陰性，提示100g・L-1 甲醛固定后的石蠟切片中BCL-6抗原活性基本丟失.較多研究認(rèn)為石蠟切片不能較好地顯示抗原的原因，不是抗原破壞，而是抗原受到遮蔽.不同抗原遮蔽的主要原因亦不相同，因此所用的修復(fù)液和修復(fù)方法也應(yīng)有所不同［9］ .Morgan等［8］ 推測(cè)引起抗原遮蔽的主要原因有:①40g・L
-1 甲醛固定過(guò)程中產(chǎn)生的甲酸可與某些蛋白質(zhì)位點(diǎn)發(fā)生十字交聯(lián)形成亞甲基橋.高溫下這種亞甲基橋可在水溶液中水解，抗原活性重新暴露.②一些蛋白質(zhì)在40g・L-1 甲醛固定和高溫浸蠟過(guò)程中，其三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使原本暴露的抗原隱藏起來(lái).③某些蛋白質(zhì)在40g・L-1 甲醛固定時(shí)產(chǎn)生大量羥基、羧基及磷�；鶊F(tuán)，這些基團(tuán)易與動(dòng)物組織中豐富的鈣離子緊密結(jié)合形成復(fù)合物，引起抗原遮蔽.
表2 不同修復(fù)液結(jié)合高壓修復(fù)后檢出BCL-6的陽(yáng)性狀況 略
用BCL-6mAb檢測(cè)經(jīng)修復(fù)后淋巴組織石蠟切片中BCL-6抗原表達(dá)情況，國(guó)外雖有報(bào)道，但所用修復(fù)液及修復(fù)方法各不相同［11，12］ ，目前尚未見(jiàn)探討40g・L-1 甲醛固定后BCL-6抗原失活機(jī)制及理想修復(fù)方法的報(bào)道.我們用微波、高壓、煮沸3種常用修復(fù)方法對(duì)4種修復(fù)機(jī)制不同的修復(fù)液的修復(fù)效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)EDTA溶液對(duì)40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原活性修復(fù)能力最強(qiáng)，其次為檸檬酸溶液，碳酸鈉鹽只有較弱的修復(fù)作用，去離子水沒(méi)有修復(fù)作用.EDTA和檸檬酸均為鈣離子強(qiáng)螯合劑.碳酸鈉鹽亦有鈣離子沉淀作用.而去離子水無(wú)結(jié)合鈣離子作用.以上結(jié)果表明，經(jīng)40g・L-1 甲醛固定后石蠟切片中BCL-6抗原失活的主要機(jī)制可能與鈣離子復(fù)合物形成有關(guān).對(duì)4種不同的修復(fù)液結(jié)合3種常用修復(fù)方法的修復(fù)效果進(jìn)行檢驗(yàn)表明，高壓修復(fù)效果最好，可能在高壓狀態(tài)下鈣離子與蛋白質(zhì)抗原形成的復(fù)合物更易解離.對(duì)4種修復(fù)液結(jié)合高壓修復(fù)的效果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)差異懸殊.EDTA溶液結(jié)合高壓修復(fù)法修復(fù)BCL-6抗原后，其檢出陽(yáng)性率及陽(yáng)性強(qiáng)度均高于其他各組，是修復(fù)石蠟切片中BCL-6抗原活性 的最隹方法.此法經(jīng)濟(jì)方便，操作簡(jiǎn)單，為進(jìn)一步研究BCL-6抗原失活及修復(fù)機(jī)制，以及研究其表達(dá)意義打下了良好基礎(chǔ).
參考文獻(xiàn):
［1］Ye BH，Lista F，Lo coco F，Knowles DM，Offit K，Chaganti RS，Dalla-favera R.Alterations of a zinc finger-encoding gene，BCL-6，in diffuse large-cell lymphoma ［J］.Science，1993;262:747-750.
［2］Dent AL，Shaffer AL，Yu X，AllmanD，Standt LM.Control of inflammation，cytokine expression，and germinal center forma-tion by BCL-6［J］.Science，1997;276:589-592.
［3］Capello D，Vitolo U，Pasqualucci L，Quattrone S，Migliaretti G，F(xiàn)assone L，Ariatti C，Gaidano G.Distribution and pattern of bcl-6mutations throughout the spectrum of B-cell neoplasia ［J］.Blood，2000;26:651-659.
［4］Yoshida S，Kaneita Y，Aoki Y，Seto M，Mori S，Moriyama M.Identification of heterologous translocation partner genes fused to the bcl-6gene in diffuse large B-cell lymphomas:5’-RACE and LA-PCR analyses of biopsy samples ［J］.Oncogene，1999;18:7994-7999.
［5］Albagli O，Lantoine D，Quief S，Quignon F，Englert C，Kerck-aert Jp，Montarras D，Pinset C，LindonC.Overexpressed BCL-6（LAZ3）oncoprotein triggers apoptosis，delays S phase pro-gression and associates with replication foci ［J］.Oncogene，1999;18:5063-5057.
［6］Tao K，Zhu XZ.Bcl-6and diffuse large B-cell lymphoma ［J］.Zhonghua Binglixue Zazhi（Natl Path J Chin），1998;27（6）:465-466.
［7］Falini B，F(xiàn)izzotti M，Pileri S，Liso A，Pasqualucci L，F(xiàn)lenghi L.BCL-6protein expression in normal and neoplastic lymphoid tissues ［J］.Ann Oncol，1997;8（Suppl2）:101-104.
［8］Morgan JM，Navabi H，Schmid KW，Jasani B.Possible role of tissue-bound calcium ions in citrate-mediated high-temperature antigen retrieval ［J］.J Pathol，1994;174:301-307.
［9］Cattoretti G，Pileri S，Parravicinic，Becker MH，Poggi S，Biful-co C，Key G，D’Amato L，Sabatlini E，F(xiàn)endale E.Antigen un-masking on formalin-fixed，paraffin-embedded tissue sections ［J］.J Pathol，1993;171:83-89.
［10］Norton AJ，Jordan S，Yeomans P.Brief，high-temperature heat denaturation（pressure cooking）:A simple and effective method of antigen retrieval for routinely processed tissues ［J］.J Pathol，1994;173:371-379.
［11］Flenghi L，Bigerna B，F(xiàn)izzotti M，Venturi S，Pasqualucci L，Pileri S，Ye BH，Gambacorta M，Pacine R，Baroni CD，F(xiàn)alini B.Monoclonal antibodies PG-B6a and PG-B6p recognize，re-spectively，a highly conserved and a formal-resistant epitope on the human BCL-6protein amino-terminal region ［J］.Am J Pathol，1996;148（5）:1543-1555.
［12］Falini B，Bigerna B，Pasqualucci L，F(xiàn)izzotti M，Martelli MF，Pileri S，Pinto A，Carbone A，Venturi S，F(xiàn)lenghi L.Distinc-tive expression pattern of the BCL-6protein in nodular lympho-cyte predominance Hodgkin’s disease ［J］.Blood，1996;87（20）:465-470.
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