免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控管理

【關(guān)鍵詞】  免疫組織化學(xué)；病理學(xué),臨床；質(zhì)控管理
免疫細(xì)胞學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的一個(gè)分支學(xué)科，它是在免疫學(xué)理論基礎(chǔ)上利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，在細(xì)胞或組織中定位抗原或抗體。免疫組化技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷和研究疾病的目的。隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)在臨床病理研究與診斷中的廣泛應(yīng)用，因其反應(yīng)步驟多，影響因素復(fù)雜，質(zhì)量控制已被越來越多的病理技術(shù)專家重視。2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用研討會(huì)上提出將質(zhì)控應(yīng)用到免疫組化技術(shù)上。本文對(duì)免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控管理進(jìn)行了探索，現(xiàn)介紹如下。
　　1  標(biāo)本的固定
    
　　為了更好地保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，必須對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定。標(biāo)本固定的好壞是影響病理診斷的關(guān)鍵，同樣也影響免疫組化的結(jié)果，所以固定是質(zhì)控的首要也是關(guān)鍵步驟。影響標(biāo)本固定主要因素有以下幾點(diǎn)。①標(biāo)本離體后固定不及時(shí)：一般離體標(biāo)本要求15 min內(nèi)必須固定[1]，最好是在手術(shù)室由專業(yè)的護(hù)士將離體的標(biāo)本用清水沖洗干凈后立即放入質(zhì)量濃度40 g/L中性甲醛內(nèi)，固定液的用量為標(biāo)本體積的5～10倍。而目前本院手術(shù)室做不到這一點(diǎn)，這就要求病理技術(shù)員在接到標(biāo)本后要及時(shí)固定，不能延誤時(shí)間。但是在手術(shù)室和路上延誤的時(shí)間不能控制。因此，呼吁臨床醫(yī)生應(yīng)和病理科聯(lián)合起來，將標(biāo)本固定地點(diǎn)放在手術(shù)室，以使標(biāo)本及時(shí)固定，減少因固定不及時(shí)而出現(xiàn)的診斷困難。②標(biāo)本固定的時(shí)間：40 g/L中性甲醛滲透速度一般是2 mm/h，隨著時(shí)間延長(zhǎng)速度會(huì)逐漸減慢，增加濃度反而會(huì)降低滲透速度。一般手術(shù)標(biāo)本用40 g/L中性甲醛固定的時(shí)間以12～24 h為佳，最長(zhǎng)不要超過72 h；如穿刺標(biāo)本可用AFF液固定2～4 h。有研究顯示，用40 g/L中性甲醛固定1周后的標(biāo)本，其組織抗原幾乎不能被檢出[1]。但是，日常工作中常常會(huì)遇到有人催發(fā)病理報(bào)告的情況，他們希望病理科的報(bào)告最好像檢驗(yàn)科那樣早晨送下午就能拿到。這種情況下只有縮短制片程序，包括固定時(shí)間，這種操作只會(huì)增加病理診斷的風(fēng)險(xiǎn)，埋下誤診的隱患。③固定液的種類及濃度不恰當(dāng)：免疫組化檢測(cè)常用的固定液有40 g/L中性甲醛、40 g/L鈣?甲醛、40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液等。穿刺標(biāo)本可用AFF液固定。固定液濃度過高、過低都會(huì)因組織固定差而導(dǎo)致組織抗原丟失或易出現(xiàn)非特異性背景染色，從而影響免疫組化結(jié)果。EDTA是用于骨組織脫鈣的螯合劑，因在脫鈣過程中對(duì)組織的破壞性小而得到廣泛使用，缺點(diǎn)是脫鈣時(shí)間太長(zhǎng)。④標(biāo)本固定時(shí)處理不當(dāng)：如淋巴結(jié)組織往往因包膜沒切開，影響了固定液的滲透，而使組織固定差。大標(biāo)本因沒切開固定，而使標(biāo)本固定不勻等，都可影響免疫組化染色。我們接診了很多低級(jí)別醫(yī)院來會(huì)診標(biāo)本，都存在以上問題，因固定差而直接影響免疫組化結(jié)果及診斷。
　　2  切片與烤片
    
　　免疫組化檢測(cè)的切片厚以3～4 μm為宜，淋巴結(jié)組織可行2 μm厚切片，太厚影響染色結(jié)果和診斷。因免疫組化反應(yīng)步驟多，易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，需要將載玻片處理后方可使用。處理方法：先將載玻片用肥皂水洗凈后，放入清潔液中浸泡12～24 h，清水沖洗2 h，蒸餾水洗5遍，體積分?jǐn)?shù)0.95乙醇浸泡后，用干凈的綢布擦干，再掛膠。掛膠方法有很多種，如： APES、鉻礬明膠液、多聚賴氨酸等。切片裱片要完整，不能有氣泡，烤片時(shí)溫度不能過高，65 ℃烤30 min即可進(jìn)行染色�？酒瑫r(shí)間過短易造成脫片，溫度過高或過長(zhǎng)可破壞抗原。
　　3  減少或消除非特異性染色
    
　　組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。常見的消除方法有：①在滴加第一抗體前用體積分?jǐn)?shù)0.02～0.05山羊血清或牛血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合。此種方法一般用于不需抗原修復(fù)的抗體或內(nèi)源性生物素較高的組織效果佳。②體積分?jǐn)?shù)0.03～0.06過氧化氫法是目前最常用的方法之一，我們認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)0.05過氧化氫處理10～15 min的效果較好。③洗滌過程中用高鹽緩沖液沖洗切片，也是消除非特異性染色的方法之一。方法是將磷酸緩沖液中加入10 g/L的氯化鈉（pH 7.4）。④稀釋抗體濃度，但必須通過陽性對(duì)照來掌握稀釋的最佳濃度。我們的實(shí)踐證明，應(yīng)用北京中杉試劑公司生產(chǎn)的PV?9000二步法試劑盒，可有效地避免內(nèi)源性生物素造成的非特異性染色，且操作簡(jiǎn)便。4  抗原修復(fù)
    
　　免疫組化在病理學(xué)上的應(yīng)用常因甲醛固定等因素影響造成抗原失活。解決因固定包埋導(dǎo)致抗原失活的問題有3個(gè)途徑：①開發(fā)新型抗體以識(shí)別甲醛固定后的組織抗原或提高免疫組化試劑的靈敏度；②用改良固定液取代甲醛；③挽救因甲醛固定而失活的抗原，即抗原修復(fù)。而后者因方法簡(jiǎn)單而增敏效果顯著，在病理技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素，目前最常用的是加熱煮沸法，少數(shù)用酶消化法。加熱抗原修復(fù)是1991年由SHI等最先報(bào)道，其機(jī)制是通過加熱打開了組織抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交聯(lián)。修復(fù)的方法有高壓法、微波法、水浴法等。英聯(lián)邦免疫細(xì)胞化學(xué)室間質(zhì)控組織（UK NEQAS?ICC）進(jìn)行的有105家實(shí)驗(yàn)室參與、歷時(shí)兩年的研究結(jié)果顯示，ER、PR染色偏弱是由于微波加熱時(shí)間不足與實(shí)驗(yàn)中操作控制不當(dāng)所致，強(qiáng)烈推薦使用高壓抗原修復(fù)[2]。國內(nèi)也有專家研究表明，目前抗原修復(fù)最突出和最頑固的問題是修復(fù)不夠。各種修復(fù)方法染色強(qiáng)度比較，高壓法>水浴法>微波法。抗原修復(fù)液常用的有枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、EDTA緩沖液（pH 8.0～9.0）等。在2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用研討會(huì)上周小鴿教授做了以下實(shí)驗(yàn)（圖1）：A類抗原在任何pH條件下，修復(fù)效果都很好；B類抗原在低和高pH時(shí)，修復(fù)效果好，但在中等pH時(shí)，修復(fù)效果很差；C類抗原隨著pH的增高，修復(fù)結(jié)果越來越好。如果實(shí)驗(yàn)室只想用1種修復(fù)液，又能兼顧3類抗原，就可選擇圖中3條曲線最靠近的區(qū)域所對(duì)應(yīng)的pH值，此處所對(duì)應(yīng)的pH為8.0～9.0。因此，他認(rèn)為高pH修復(fù)液比低pH修復(fù)液更好。我們認(rèn)為高壓修復(fù)具有壓力穩(wěn)定、受熱均勻、陽性檢出率和陽性強(qiáng)度高、背景著色少等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)核染色陽性的抗原用pH 9.0的EDTA修復(fù)液效果較好，胞漿胞膜染色陽性的用pH 8.0的EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)的效果較好，但如果采用pH 9.0的EDTA在高壓修復(fù)時(shí)易脫片。高壓修復(fù)的方法是：先將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液煮沸，將切片放入高壓鍋內(nèi)，將壓力加熱至最大（105 kPa）1～2 min,加熱功率不要大于1 000 W。有研究表明，Ki67與P53在使用電磁爐加熱時(shí)，隨著功率的增強(qiáng)，陽性強(qiáng)度反而減弱。我們認(rèn)為只要功率在800 W左右，不管是電磁爐還是電爐加熱對(duì)免疫組化的結(jié)果影響都不大。
　　5  標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)照
    
　　免疫組化對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)立在免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化中是極其必要的。隨著病人法律意識(shí)的不斷增強(qiáng)，醫(yī)患之間的矛盾越來越大，病理醫(yī)師的診斷風(fēng)險(xiǎn)也越來越大。這就要求醫(yī)生對(duì)染色結(jié)果要有正確判斷，同時(shí)也對(duì)病理技術(shù)人員提出了設(shè)立陽性和陰性對(duì)照的要求，這不但是對(duì)病人負(fù)責(zé)，也是保護(hù)自己的一種方式。陰性對(duì)照是用確定不含有待測(cè)抗原的組織作為陰性對(duì)照組織，陽性對(duì)照是對(duì)照組織中含有已知的抗原[3]。我們認(rèn)為在日常工作中設(shè)置陽性對(duì)照最關(guān)鍵，通常是用闌尾來做陽性對(duì)照組織，因?yàn)殛@尾中含有多種組織成分如上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。
　　圖1  3種抗原不同pH條件下修復(fù)效果（略） 
　　總之，要做出好的免疫組化結(jié)果，除了要求病理技術(shù)人員掌握豐富的理論知識(shí)外，還要求有較強(qiáng)的責(zé)任心，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作，只有這樣才能更好地將免疫組化技術(shù)應(yīng)用于臨床，服務(wù)于病人。
   
【參考文獻(xiàn)】
  　　[1]王小亞,崔全才. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社, 2007：47.

　　[2]王伯沄. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社, 2007：19?20.

　　[3]王伯沄, 李玉松. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2001：365.

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