三葉青的毒理學(xué)研究
關(guān)鍵字： 毒理學(xué)三葉青為葡萄科植物三葉崖爬滕Tetrastigma hems-leyanum Diels et Gilg的根 ［1］ ，又名金線吊葫蘆、石老鼠。在浙江民間素有食用習(xí)俗，為評價其安全性。我們按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中“食品安全性毒理學(xué)評價試驗”進(jìn)行實驗 ［2］ ，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1 樣品
三葉青塊根，切片，10倍水浸泡2h，每次1h，收集煎液。濃縮成1g生藥/ml濃度，由杭州天惠醫(yī)藥科技有限公司提供。按民間食用習(xí)慣15g/人/d計算。
2 實驗動物和檢測條件
實驗用ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供，清潔級，醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號為2001001，醫(yī)學(xué)實驗動物設(shè)施合格證號為2001001。實驗用SD大鼠由浙江省實驗動物中心提供，清潔級:醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號為2001001，醫(yī)學(xué)實驗動物設(shè)施合格證號為2001001。實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2001。檢測環(huán)境條件:溫度范圍20℃～25℃，相對濕度范圍60%～70%。實驗動物試驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3天，染毒前禁食過夜，不限制飲水。
3 實驗方法
3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗
3.1.1 實驗動物 選用健康、成熟、體重180～220g SD大鼠20只，雌雄各半。
3.1.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗方法將大鼠分為10.0g/kg，體重劑量組，每組20只，雌雄各半。大鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀察14天，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。
3.1.3 觀察指標(biāo) 染毒后，觀察大鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限2周。
3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗
3.2.1 實驗動物 選用健康、成熟、休重18～22g ICR小鼠20只，雌雄各半。
3.2.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗方法將小鼠分為40.0g/kg體重劑量組，每組20只，雌雄各半。小鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀察14天，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。
3.2.3 觀察指標(biāo) 染毒后，觀察小鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限兩周。3.3 Ames試驗
3.3.1 試驗菌株 選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌，共四株，即TA 97a 、TA 98 、TA 100 、TA 102 。由上海勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究所提供，經(jīng)生物學(xué)鑒定合格后進(jìn)行試驗。
3.3.2 劑量選擇及陽性對照物 試驗采用平板摻入法。樣品以蒸餾水稀釋至相應(yīng)劑量。用TA 100 菌株的非代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試驗，結(jié)果在劑量為5000μg/皿時未出現(xiàn)明顯的增菌和抑菌現(xiàn)象，故正式試驗時選擇試驗濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個劑量組，外加陰性對照（蒸餾水，DMSO）和陽性對照組（9-氨基吖啶、2，7-二氨基芴、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴、絲裂霉素C、1，8-二羥基蒽醌），每種菌株每個測試濃度設(shè)三皿平行，在加和不加S 9 條件下進(jìn)行試驗。 3.3.3 觀察指標(biāo) 直接計數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回菌落數(shù)。
3.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗
3.4.1 實驗動物 實驗用ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供，體重25～28g。
3.4.2 劑量和給藥方法 小鼠隨機(jī)分5.0、10.0、20.0g/kg體重三個劑量組，一個陰性對照組（灌胃等容量蒸餾水）和一個陽性對照組（絲裂霉素C2.0mg/kg體重），每組10只。樣品以灌胃方式給予，連續(xù)5天，每天1次，對照組也相同處理。于首次灌胃后第35天脫臼處死，每組隨機(jī)選5只小鼠分別取兩側(cè)附睪，制成吸濾液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，用1%伊紅染色。
3.5 觀察指標(biāo) 高倍鏡下觀察精子形態(tài)并計數(shù)，每只小鼠計數(shù)完整精子1000條，計算精子畸形發(fā)生率（%）。
4 實驗結(jié)果
4.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗 實驗期間，各組大鼠均未見明顯癥狀，也無死亡。三葉青對雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于100g/kg體重，屬實際無毒。
4.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗 實驗期間，各組小鼠均未見明顯癥狀，也無死亡。三葉青對雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于40.0g/kg體重，屬實際無毒。
4.3 Ames試驗 各菌株回變菌落數(shù)見表1。表1 三葉青Ames平扳摻入試驗結(jié)果（略）從實驗結(jié)果可見，不同濃度受試物在加和不加S 9 條件下的回變菌落與陰性對照組相近似，而陽性對照回變菌落數(shù)均高于陰性對照回變菌落數(shù)2倍以上。說明三葉青 Ames試驗檢測結(jié)果為陰性。
4.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 三葉青對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響見表2。表2 三葉青對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響（略）注: * P<0.01（與陰性對照組比較）
用卡方檢驗統(tǒng)計，雌雄各劑量組與陰性對照組比較，微核千分率均無顯著性差異，而陽性對照組微核率則顯著高于陰性對照組，其差異有顯著性（P<0.01）。說明三葉青 對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率未見明顯影響。
4.5 小鼠精子畸形試驗 三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響見表3。表3 三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響（略）注: * P<0.01（與陰性對照組比較）各劑量組與陰性對照組比較，小鼠精子畸形發(fā)生率均無顯著性差異，而陽性對照組則明顯高于陰性對照組，其差異有顯著性意義（P<0.01）。說明三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率未見明顯影響。
5 結(jié)論
三葉青按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版） 中“食品安全性毒理學(xué)評價試驗:第一階段大鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死LD50），雌雄兩性別均大于100g/kg體重:小鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死量（LD50），雌雄兩性別均大于40.0g/kg體重，按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)判定，屬實際無毒;第二階段Ames試驗結(jié)果為陰性，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗結(jié)果均為陰性，說明三葉青未顯示有致突變性。
作者單位:
1 310013浙江杭州，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
2 浙江杭州，武警浙江總隊機(jī)關(guān)門診部
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