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IL?18基因多態(tài)性與原發(fā)性干燥綜合征的相關(guān)性
作者：李恩澤 辛苗苗 胡彬 閆麗萍 李慧
【摘要】 目的 探討IL?18基因?137G/C、?607C/A位點(diǎn)多態(tài)性及其血清水平與原發(fā)性干燥綜合征的相關(guān)性。方法 提取受試者白細(xì)胞DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)?限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)28例原發(fā)性干燥綜合征病人和52例健康對(duì)照者IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)多態(tài)性，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)兩組血清IL?18含量。結(jié)果 兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較差異均無顯著性(P>0.05)。原發(fā)性干燥綜合征組血清IL?18水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有顯著性(t=24.06,P<0.001)。原發(fā)性干燥綜合征組不同基因型間血清IL?18水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。結(jié)論 血清IL?18水平表達(dá)降低可能是原發(fā)性干燥綜合征的促發(fā)因素。
【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素18;基因型;基因頻率;原發(fā)性干燥綜合征
[ABSTRACT] Objective To investigate the association of polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene and its serum level with primary Sjogren’s syndrome. Methods The DNA of white blood cells were extracted from subjects,polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism (PCR?RFLP) method was applied to detect polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene in 28 patients with primary Sjogren’s syndrome (group A) and 52 healthy controls (group B); serum IL?18 was measured in both groups by ELISA. Results There was no differences in IL?18 genotype frequency and allele frequency at position ?607 and ?137 between group A and group B (P>0.05). Serum IL?18 in group A was significantly lower than that in group B, with statistical difference (t=24.06,P<0.001). The differences of serum IL?18 levels between different genotypes in group A did not reach statistical significance (P>0.05). Conclusion Decrease of serum IL?18 is likely to be a precipitating factor of primary Sjogren’s syndrome.
[KEY WORDS] interleukin?18; genotype; gene frequency; Sjogren’s syndrome
原發(fā)性干燥綜合征(PSS)是以口、眼干燥及關(guān)節(jié)腫痛為常見表現(xiàn)的一種全身性自身免疫性疾病，常呈現(xiàn)家族聚集性。白細(xì)胞介素?18(IL?18)可誘導(dǎo)IFN?γ、IL?2等細(xì)胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤的作用，并參與某些自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展。PSS病人CD4+T細(xì)胞水平降低，導(dǎo)致Th1和Th2亞群的分布出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失常。本文對(duì)PSS病人IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)多態(tài)性以及血清IL?18水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其與PSS發(fā)生的相關(guān)性�，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象
收集我院風(fēng)濕免疫科就診的PSS病人(PSS組)28例，男1例，女27例，年齡27～84歲，平均為55.96歲，均符合2002年P(guān)SS國(guó)際分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選健康獻(xiàn)血員52例作為對(duì)照組，男3例，女49例，年齡22～75歲，平均53.2歲;排除相應(yīng)疾病家族史。兩組研究對(duì)象均無血緣關(guān)系，在年齡和性別比例上均無顯著性差異。
1.2 檢測(cè)方法
1.2.1 DNA制備 采集受試者空腹靜脈血5 mL至EDTA?K2抗凝管中，顛倒混勻。離心后提取下層血漿和白細(xì)胞層約1 mL移入高壓滅菌的離心管中，用酚?氯仿?異戊醇法抽提細(xì)胞DNA。將DNA沉淀移入1.5 mL的LEP管中，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀自然干燥后，加無菌純水充分溶解，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>
1.2.2 PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)擴(kuò)增 IL?18基因?607位點(diǎn)的特異性引物，2條特異性正向引物序列分別為5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAAT?TATTAC?3′和5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAA?TTATTAA?3′，共同反向引物序列為5′?TAACCT?CATTCAGGACT?3′，質(zhì)控正向引物序列為5′?CTT?TGCTATCATTCCAG?3′。?137位點(diǎn)2條特異性正向引物序列分別為5′?CCCCAACTTTTACGGA?AGAAAAG?3′和5′?CCCCAACTTTTACGGAAG?AAAAC?3′，共同反向引物序列為5′?AGGAGGGC?AAAATGCACTGG?3′，質(zhì)控正向引物序列為5′?CCAATAGGACTGATTATTCCGCA?3′。?607位點(diǎn)的PCR總體系為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L 的dNTP，約30 ng基因組DNA和1 U Taq聚合酶。質(zhì)控正向引物0.4 μmol/L，一種特異性正向引物0.4 μmol/L，共同反向引物0.8 μmol/L。擴(kuò)增參數(shù)：首先94 ℃預(yù)變性4 min;然后94 ℃變性20 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共行7個(gè)循環(huán);隨后94 ℃變性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取2條特異性正向引物分別擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80 V，40 min，溴化乙錠染色，紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并鑒定等位基因頻率。?137位點(diǎn)的PCR總體系為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，約30 ng基因組DNA和1 U Taq聚合酶。質(zhì)控正向引物0.5 μmol/L，一種特異性正向引物0.5 μmol/L，共同反向引物1.0 μmol/L。擴(kuò)增參數(shù)：首先94 ℃預(yù)變性2 min;然后94 ℃變性20 s，68 ℃退火60 s，共行5個(gè)循環(huán);隨后94 ℃變性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。取2條特異性正向引物分別擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80 V，40 min，溴化乙錠染色，紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并鑒定基因型。
2 結(jié) 果
2.1 IL?18基因?607位點(diǎn)多態(tài)性電泳
每份標(biāo)本分別用2條特異性正向引物做2管PCR，301 bp處為質(zhì)控條帶，196 bp處是A/C等位基因特異性擴(kuò)增片段。部分標(biāo)本?607位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)電泳結(jié)果如圖1。標(biāo)本①只有C等位基因處可觀察到長(zhǎng)196 bp特異性擴(kuò)增片段，所以其基因型為CC;標(biāo)本②～④的2管PCR產(chǎn)物電泳后均可觀察到長(zhǎng)196 bp特異性擴(kuò)增片段，故其為CA基因型;標(biāo)本⑤只有A等位基因處可觀察到長(zhǎng)196 bp特異性擴(kuò)增片段，其基因型則為AA。
2.2 IL?18基因?137位點(diǎn)多態(tài)性電泳
圖2為部分標(biāo)本IL?18基因?137位點(diǎn)多態(tài)性電泳檢測(cè)結(jié)果，每份標(biāo)本分別用2條特異性正向引物做2管PCR，446 bp處為質(zhì)控條帶，261 bp處為G/C等位基因特異性擴(kuò)增片段。標(biāo)本②和④只有G等位基因處可觀察到長(zhǎng)261 bp特異性擴(kuò)增片段，所以其基因型為GG;標(biāo)本③和⑤在兩管PCR產(chǎn)物電泳后均可觀察到長(zhǎng)261 bp特異性擴(kuò)增片段，其基因型為GC;標(biāo)本①只有C等位基因處可觀察到長(zhǎng)度為261 bp特異性擴(kuò)增片段，其基因型則為CC。
2.3 兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率的比較
兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無顯著意義(P>0.05)。見表1、2。
2.4 兩組血清IL?18水平的比較
PSS組病人和對(duì)照組的血清IL?18水平分別為(49.37±15.77)和(476.79±93.17) ng/L，兩組比較差異有顯著性(t=24.06,P<0.001)。
2.5 IL?18不同基因型病人血清IL?18水平比較
PSS組病人IL?18基因?607位點(diǎn)CC、CA、AA基因型的血清IL?18水平分別為(47.97±13.58)、 (951.41±9.6)、(48.97±9.36)ng/L，IL?18基因?137位點(diǎn)GG、GC、CC基因型的血清IL?18水平則分別為(50.05±9.97)、(48.16±11.60)、(52.80±0.00)ng/L，不同基因型間血清IL?18水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。
表1 IL?18基因?607 C/A位點(diǎn)多態(tài)性分布及其比較(例(χ/%))組別n基因型頻率CCCAAA等位基因頻率CA對(duì)照組5213(25.0)28(53.8)11(21.2)54(51.9)50(48.1)PSS組287(25.0)14(50.0)7(25.0)28(50.0)28(50.0)
表2 IL?18基因?137 G/C位點(diǎn)多態(tài)性分布及其比較(例(χ/%))組別n基因型頻率GGGCCC等位基因頻率GC對(duì)照組5238(73.1)13(25.0)1(1.9)89(85.6)15(14.4)PSS組2822(78.6)5(17.9)1(3.5)49(87.5)7(12.5)
3 討 論
PSS是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，在多種因素的共同作用下，可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和體液免疫異常，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞對(duì)靶器官的進(jìn)行性浸潤(rùn)，造成靶器官功能障礙。研究表明，PSS病人疾病活動(dòng)期體內(nèi)T細(xì)胞亞群數(shù)量分布存在明顯異常，表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞水平降低，而CD8+T淋巴細(xì)胞水平升高[2?3]。CD4+T淋巴細(xì)胞水平降低，導(dǎo)致Th1和Th2亞群的分布出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失常，如PSS活動(dòng)期病人體內(nèi)IFN?γ等細(xì)胞因子水平有明顯下降，對(duì)疾病的進(jìn)展影響較大[4]。IL?18屬于IL?1家族成員，它可誘生IFN?γ等細(xì)胞因子。INF?γ的生成可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，因此認(rèn)為，IL?18是調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的重要因子[5]。MATERA等[6]研究表明，IL?18在IL?12誘導(dǎo)新生CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞時(shí)起加強(qiáng)作用，在IL?12協(xié)同作用下，IL?18可強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFN?γ等Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致組織損傷。本研究結(jié)果顯示，PSS病人血清IL?18水平明顯低于對(duì)照組，推測(cè)PSS病人血清IL?18水平降低可能導(dǎo)致Th1細(xì)胞分泌IFN?γ水平下降，Th2細(xì)胞分泌IL?4水平相對(duì)增高。進(jìn)一步引起Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)下調(diào)而Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)相對(duì)增強(qiáng)，Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡擴(kuò)大，使機(jī)體在多種因素的侵襲下引起免疫反應(yīng)異常，通過各種細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)的作用，造成PSS病人組織的損傷。 細(xì)胞因子的表達(dá)量受基因調(diào)控，編碼細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄效率下降可導(dǎo)致細(xì)胞因子的表達(dá)量降低。近年來，對(duì)IL?18基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與疾病的關(guān)系研究有諸多報(bào)道，許多研究結(jié)果顯示，IL?18 基因多態(tài)性能影響疾病的發(fā)生、發(fā)展[7?9]。IL?18基因?607C/A和?37G/C位點(diǎn)分別存在核因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和組蛋白H4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，SIVA等[9]研究認(rèn)為其多態(tài)性可能影響IL?18的轉(zhuǎn)錄水平。張平安等[10]采用體外PBMC培養(yǎng)和刺激方法研究IL?18 基因型和表型的關(guān)系，結(jié)果表明兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)IL?18分泌和表達(dá)無明顯影響。本研究對(duì)IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果表明，兩組IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率均無顯著性差異，未得出IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與PSS相關(guān)的結(jié)論。同時(shí)，對(duì)不同基因型間的血清IL?18水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也未得出基因多態(tài)性可影響IL?18血清水平的結(jié)論。由此推斷，IL?18基因?607C/A、?137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與某些疾病的易感性有關(guān)，并非完全是通過對(duì)于其表達(dá)量的影響而發(fā)揮作用，可能是該位點(diǎn)與其他相鄰位點(diǎn)存在連鎖失衡的共同結(jié)果，也可能與樣本大小、種族差異、地域差異以及遺傳因素和環(huán)境因素之間存在著復(fù)雜的相互作用等原因有關(guān)。
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