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HPLC法測(cè)定注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸單苷的含量
摘 要：注射用復(fù)方甘草酸苷通常是應(yīng)用在慢性肝炎和肝功能異常的治療和改善當(dāng)中，注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸單苷是最為主要的成分，其含量對(duì)于藥品的有效會(huì)產(chǎn)生非常明顯的影響，所以其含量的測(cè)定就顯得格外的重要。本文主要分析了HPLC法測(cè)定注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸單苷的含量，希望能夠給相關(guān)的研究人員提供一定的參考和借鑒。
關(guān)鍵詞：HPLC法;含量測(cè)定;甘草酸苷
注射用復(fù)方甘草酸苷當(dāng)中主要有甘草酸單銨鹽、甘草酸和L-鹽酸半胱氨酸三種物質(zhì)，它對(duì)慢性肝炎有著十分有效的治療效果，而這種藥物的療效和主要成分甘草酸單苷的含量有著十分密切的關(guān)系，所以我們?cè)谘芯康倪^(guò)程中對(duì)注射液中的甘草酸單苷的含量進(jìn)行測(cè)定是有著十分重大的現(xiàn)實(shí)意義的，在測(cè)定的過(guò)程中最為常用的就是HPLC法，以下本文對(duì)其進(jìn)行研究。
一、儀器與試藥
高效液相系統(tǒng)(Waters2695泵，Waters2996二極管陣列檢測(cè)器，WatersEmpower色譜工作站);乙腈為色譜純。樣品來(lái)源：江蘇揚(yáng)州中寶藥業(yè)有限公司;樣品批號(hào)：20030729、2003073、20030731。參比樣品來(lái)源：日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社(進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)：H20030185)，參比樣品批號(hào)：00344。甘草酸單銨對(duì)照品：成都圣諾科技發(fā)展有限公司，HPLC純度99.5%。
二、方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱：KromasilC18，5μ，4.6×250mm，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相：乙腈-0.01mol/L磷酸溶液(38∶62)，流速1.0ml/min，在室溫下操作，理論板數(shù)按甘草酸苷計(jì)算應(yīng)不低于2000。
2.2 供試品溶液的制備
精確稱(chēng)取本品10mg，將其用適量的注射水溶解，用5ml的胡涉水將其放置在25ml的容量瓶當(dāng)中，加入適量的流動(dòng)相到刻度的位置，使溶液的濃度能夠達(dá)到400μg/ml的溶液，這樣就完成了供試品溶液的制備。
2.3 對(duì)照品溶液的制備
精確稱(chēng)取甘草酸單銨對(duì)照品適量，將其用注射水進(jìn)行溶解處理，加入適量的流動(dòng)相將溶液制成甘草酸單苷銨，其濃度為530μg/ml的對(duì)照溶液。
2.4 線性關(guān)系考察
用天平精確稱(chēng)取甘草酸單苷銨對(duì)照品54.6mg，也就是41.2mg的甘草酸單苷對(duì)照品，將其放置在容積為50ml的容量瓶當(dāng)中，用水將其定溶到刻度的位置，分別量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml溶液，將其放置在容積為10ml的容量瓶當(dāng)中。加入適量的流動(dòng)相將其定溶到刻度的位置，每一毫升的溶液當(dāng)中應(yīng)分別有329.6μg、370.8μg、412.0μg、453.5μg494.4μg的溶液。分別稱(chēng)取10μl的溶液放入到液相色譜儀當(dāng)中，對(duì)不同溶液的主峰面積進(jìn)行全面的測(cè)定，同時(shí)還要將濃度當(dāng)做是橫坐標(biāo)，主峰面積當(dāng)做是縱坐標(biāo)對(duì)其進(jìn)行線性回歸返程的計(jì)算，在研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)甘草酸酐在329.6-494.4μg的范圍之內(nèi)都能體現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系。
2.5 重復(fù)性試驗(yàn)
取線性測(cè)定過(guò)程中濃度為420μg/ml的樣品，放入到液相色譜儀當(dāng)中，連續(xù)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)樣處理6次，檢測(cè)到的主峰面積平均值達(dá)到了4092，RSD達(dá)到;額0.06%這也充分的證明這種檢測(cè)方法的重復(fù)性非常好。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取線性測(cè)定中濃度為412.0μg/ml樣品，將其分別在0、4、8、12、24h進(jìn)行進(jìn)樣處理，對(duì)其峰面積進(jìn)行詳細(xì)的記錄，峰面積的平均值達(dá)到了4084552，RSD達(dá)到了0.10%，這一樣品在24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，RSD數(shù)值為0.10%，這也充分的標(biāo)明樣品在24h之內(nèi)的穩(wěn)定性比較強(qiáng)。
2.7 回收率試驗(yàn)
在研究的過(guò)程中主要要按照高、中、低三個(gè)濃度梯度對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)處理，同時(shí)在這一過(guò)程中還要精確稱(chēng)取甘草酸單銨對(duì)照品10.6、13.25、15.9mg每個(gè)準(zhǔn)備3份，將其放置在容積為25ml的容量瓶當(dāng)中，加入0.2ml的氨試液和少量的水，使藥品充分的溶解，加入適量的水將其稀釋到刻度的位置，此外還要充分的搖勻，將其當(dāng)做是對(duì)照品溶液，嚴(yán)格按照甘草酸苷測(cè)定的方法對(duì)其進(jìn)行處理和操作，對(duì)回收率進(jìn)行全面的計(jì)算。計(jì)算的結(jié)果如表1所示：從表1當(dāng)中我們也可以看出這種方法在回收率方面符合相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和要求。
表1 甘草酸苷回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.8 甘草酸苷的含量測(cè)定
精密稱(chēng)取本品10mg，用5ml注射用水溶解，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，制成甘草酸苷400μg/ml溶液，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液2.5ml置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成甘草酸苷100μg/ml溶液，作為預(yù)試液。取預(yù)試液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰峰高約為滿(mǎn)量程的80%～90%，再取供試品溶液10μl，注入液相色譜議，記錄色譜圖。另取甘草酸苷對(duì)照品，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。依本法測(cè)定三批樣品，結(jié)果為，其標(biāo)示量(%)分別為20030729，101.
10;20030730，103.29;20030731，100.02。其參比樣品為103.19。
三、討論
注射用復(fù)方甘草酸苷為甘草酸單銨鹽、鹽酸半胱氨酸、甘氨酸制成的注射用粉劑，主要用于治療慢性肝炎，改善肝功能異常，也可用于治療濕疹、皮膚炎，蕁麻疹，目前廣泛地應(yīng)用于臨床。本文所討論的用高效液相色譜法對(duì)注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸單苷含量進(jìn)行測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，能有效控制樣品中甘草酸單銨的含量符合含量測(cè)定的方法學(xué)要求，適用于本品的測(cè)定。
高效液相色譜的分離過(guò)程。同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開(kāi)始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開(kāi)始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。
不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(zhǎng)展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
高效液相色譜分析的流程。由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類(lèi)似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
參考文獻(xiàn)：
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