妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的實驗研究進展

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的實驗研究進展 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病（gestational trophoblast disease，GTD）是一組嚴(yán)重危害育齡婦女健康的婦科疾病，其包括葡萄胎（hydatidiform mole，HM）、侵蝕性葡萄胎（invasive hydatidiform mole，IHM）、絨癌（choriocarcinoma，CCA）和一類極為少見的胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（placenta site trophoblastic tumor，PSTT）。滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（gestational trophoblastic tumor，GTT）系指GTD中除HM以外的全部病變［1］。我國是此類疾病的高發(fā)國度之一。多年來學(xué)者們對該病從不同層面進行了多角度、大規(guī)模的研究�，F(xiàn)將ＧＴＤ實驗研究的進展做一綜述。

1 人絨毛膜促性腺激素與GTD

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gondtrophin，HCG）是一種糖蛋白激素，也是目前公認(rèn)的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾�。℅TD）最重要的腫瘤標(biāo)志物。其相關(guān)分子組成了HCG分子家族［2］。

業(yè)已證實［3］：正常妊娠或患GTD時，血液和尿中可出現(xiàn)多種形式的HCG及其降解代謝產(chǎn)物，合體滋養(yǎng)細(xì)胞可直接分泌非缺刻HCG（整分子HCG）、非缺刻游離βHCG（F-βHCG）和大分子游離α亞單位。整分子HCG分泌后被與滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)性巨噬細(xì)胞分泌的缺刻酶分解成缺刻HCG（nicked HCG，HCGn，指在P47與P48之間缺少肽鍵）由于HCGn不穩(wěn)定，很快就被分解成為缺刻游離βHCG和游離α亞單位。缺刻游離βHCG最終在腎臟被代謝為核心片段（HCGβcf）。另外，非缺刻游離β還可以由滋養(yǎng)細(xì)胞緩慢分泌或由非缺刻HCG代謝而來。在妊娠及GTD患者的血清中除了HCGβcf的濃度極低外，其他各種分子類型的HCG在血中都有一定濃度。正常妊娠時血F-βHCG的水平很低，約占HCG濃度的0.5%~0.9%，患GTD時，由于非缺刻HCG的降解增強會導(dǎo)致F-βHCG的比例異常升高，據(jù)報道其水平較正常妊娠時增加4～100倍。因此，當(dāng)血中測到高濃度F-βHCG時則高度提示有滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的存在。此外，F(xiàn)-βHCG還可用于葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨癌的鑒別。研究表明，F(xiàn)-βHCG/總HCG的比值與GTD的類型有強相關(guān)性，主要與滋養(yǎng)細(xì)胞分化有關(guān)，其比值在葡萄胎最低，在絨癌最高。有研究證實［4］：在15個包括絨癌的腫瘤細(xì)胞系體外培養(yǎng)液中檢測到核心片段（HCGβcf）證明其可直接由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。在葡萄胎清宮術(shù)后監(jiān)測患者血中HCGβcf的濃度能夠早期預(yù)測惡性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生。

高糖基化HCG是HCG的一個相關(guān)分子，由未分化或低分化的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌產(chǎn)生。與規(guī)則HCG相比，高糖基化HCG亞基上修飾的糖基比例顯著增多，糖基分化質(zhì)量更大，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。在妊娠初期、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞是主要的滋養(yǎng)層細(xì)胞，相應(yīng)的高糖基化HCG水平分泌增多，揭示高糖基化HCG水平與早期妊娠的發(fā)展、滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。高糖基化HCG具有特殊的侵襲性，在異位妊娠、Down綜合征、先兆子癇中也有異常分泌。

國內(nèi)外關(guān)于HCG的測定方法很多，近年來主要為免疫測定方法，包括放射免疫測定法、免疫放射測定法和酶聯(lián)免疫測定法。隨著實驗醫(yī)學(xué)的進步，自動化和超速梯度離心法等技術(shù)的發(fā)展普及，用單克隆抗體進行免疫熒光標(biāo)記的分光光度測定法已逐漸得到普及。這不僅使測定方法的靈敏度有了大幅度的提高，而且也大大提高了檢測的特異性。目前的技術(shù)已可以測定HCG的不同亞單位。晚近研究發(fā)現(xiàn)：高糖化HCG（hyper-glycosylated HCG）在GTT患者中含量極高［5］，它是絨癌細(xì)胞分泌的主要相關(guān)分子，其分子含有兩個O鍵連接的寡糖側(cè)鏈及1個大的N鍵連接的寡糖側(cè)鏈，故又被稱為侵蝕性滋養(yǎng)細(xì)胞抗原（invasive trophoblast antigen，ITA）其對GTT的診斷具有獨特的價值。另外，在唐氏妊娠（Down pregnancy）時，ITA的含量也有所增高，而正常妊娠時其血清含量則很低。因此，ITA可作為鑒別正常與異常妊娠的重要指標(biāo)，尤其對GTD的診斷具有獨特的參考價值［6］。

2 端粒酶與GTD

端粒是位于染色體末端的一段富含C的重復(fù)DNA序列，它在維持染色體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和死亡中期重要的作用。正常情況下人類細(xì)胞中測不到端粒酶（telomerase）的活性。在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和生長過程中，具有不同程度的端粒酶活性表達，研究證實在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中端粒酶起到重要的作用［7］。Amezcua等［8］系統(tǒng)研究了端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的表達與持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者中均可測出端粒酶活性及hTERT的表達，而在非持續(xù)性的葡萄胎患者中，hTERT表達率僅為54%。hTERT的表達與持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病明顯相關(guān)。此外，葡萄胎患者在清宮術(shù)后，如果葡萄胎組織不表達hTERT，則該患者100%不會發(fā)展成為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。結(jié)果說明，檢測葡萄胎患者葡萄胎組織中hTERT的表達，在判定患者能否在清宮術(shù)后自發(fā)性消退方面有潛在的臨床價值。研究表明［9］：在侵蝕性葡萄胎及絨癌組織中端粒酶的活性顯著高于正常絨毛及葡萄胎組織從而被認(rèn)為是葡萄胎早期診斷的重要生物學(xué)參數(shù)。

3 金屬蛋白酶及其抑制物與GTD

金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及其抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）對腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移起到重要的作用［10］。在滋養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍治g性葡萄胎，進而轉(zhuǎn)變?yōu)榻q癌的過程中，必須多次溶解血管內(nèi)皮基膜，MMP能降解基膜的IV型膠原，促進惡變及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。正常情況下MMP以酶原形式與TIMP結(jié)合，TIMP活性受到抑制，故MMP的過度表達可作為預(yù)測葡萄胎惡變及早期診斷的重要指標(biāo)之一。Vegh研究發(fā)現(xiàn)：與正常胎盤及葡萄胎妊娠相比，絨癌細(xì)胞MMP-1及MMP-2表達明顯增強，而TIMP的表達明顯減弱。李志英等用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測到22例正常早孕絨毛及37例葡萄胎組織中MMP-9、MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達量，結(jié)果顯示：MMP-9/TIMP-1比值在發(fā)生惡變的葡萄胎組織中明顯高于未發(fā)生惡變的葡萄胎組織，認(rèn)為MMP-9、TIMP-1表達量的比值可作為葡萄胎惡變的一項監(jiān)測指標(biāo)［11］。

4 GTD的分子生物學(xué)研究進展

隨著對人類疾病病因和發(fā)病機制研究的不斷深入，學(xué)者們越來越認(rèn)識到絕大多數(shù)疾病，甚至所有疾病的發(fā)生發(fā)展都與患者的遺傳背景或其改變有關(guān)，只有從基因水平去研究疾病，才能找到致病的根本原因，也才能對疾病進行最有效的防治。分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，為GTD的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4.1 葡萄胎的DNA檢測技術(shù) PCR、流式細(xì)胞術(shù)、DNA指紋圖，Southern blot Northern blot、FISH等新興分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，使GTD的研究已由細(xì)胞水平深入到分子水平［12］。遺傳學(xué)研究證實［13］：葡萄胎作為一種病理生殖現(xiàn)象在遺傳構(gòu)成上有不同于其他腫瘤的特點;完全性葡萄胎（CHM）其染色體DNA完全來自于父源而無母源成分，是由于卵子發(fā)育異常所導(dǎo)致的染色體丟失或失活所形成的“空卵”與一個正常精子（23X）受精后，核內(nèi)DNA復(fù)制加倍而成，或是染色體正常卵與雙精子受精所形成的;前者稱為純合子（homozygte）葡萄胎，染色體核型為46，XX;后者稱為雜合子（heterozygote）葡萄胎，染色體核型為46XY或46，XX；有學(xué)者認(rèn)為：雜合子葡萄胎易發(fā)展為持續(xù)性葡萄胎或發(fā)生惡變［14］，另一類葡萄胎即部分性葡萄胎（PHM）則含有父母雙方的DNA成分，其中父源DNA為母源的2倍，認(rèn)為是由于染色體正常的卵子與雙精子受精所致，為三倍體，大多數(shù)核型為69，XXY或69，XXX。鼠配子移植試驗成功地揭示了葡萄胎發(fā)生的機制［15］：將父源或母源早期生殖細(xì)胞核移植至不含卵原核的卵細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)受精卵染色體全部來源于母方時，胚鼠可發(fā)育成25個中胚葉節(jié)階段，但無滋養(yǎng)細(xì)胞生長。而當(dāng)受精卵染色體全部來源于父方時，其滋養(yǎng)細(xì)胞增生活躍。研究證實：父源性基因成分對控制滋養(yǎng)細(xì)胞增生是十分重要的，完全性葡萄胎與部分性葡萄胎均可表現(xiàn)為過多的父源性染色體，以致促使滋養(yǎng)細(xì)胞的超常增生。

20世紀(jì)90年代后期，更為精細(xì)的第二代微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)問世，該技術(shù)可對微衛(wèi)星DNA序列進行檢測、分析。能夠迅速、準(zhǔn)確地判定葡萄胎的來源［16］，短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandom repeat，STR）亦稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），其廣泛分布于人類整個基因組中，約占10%左右。其基本構(gòu)成單位-核心序列1～6bp，呈串聯(lián)重復(fù)排列而成。按核心序列堿基數(shù)不同可分別稱為單、二、三、四、五、六-核苷酸。其中以（CA/GT）n簡稱（CA）n重復(fù)序列最多，平均每6~60bp的DNA就存在一個（CA）n，重復(fù)次數(shù)約15～16次。這類基因順序多位于基因非編碼區(qū)以及染色體的近端粒區(qū)，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目不同。與其他DNA多態(tài)標(biāo)記一樣，微衛(wèi)星DNA也呈孟德爾共顯性方式遺傳。

迄今，此類技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤分子遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，有學(xué)者報道［17］應(yīng)用PCR-微衛(wèi)星多態(tài)分析方法鑒定葡萄胎DNA的來源，探討其遺傳構(gòu)成及其與GTD發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

4.2 基因芯片技術(shù) 基因芯片（gene chip）又稱DNA芯片或cDNA微陣列（cDNA microarry）技術(shù)，它是一項劃時代意義的生物技術(shù)，它綜合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物物理化學(xué)、微電子技術(shù)等學(xué)科的最新技術(shù)，具有對生物分子快速處理的能力。其具備了信息量大、處理速度快、所需樣本量小、污染少等優(yōu)點。迄今，此項技術(shù)已在婦科腫瘤的研究中得到應(yīng)用［18］。

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