抗青霉素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

抗青霉素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

Preparation and primary application of monoclonal antibody against benzylpenicillin

　　 AIM: To develop monoclonal antibody(mAb) against benzylpenicillin and to establish a Sandwich ELISA method for relative quantitative analysis of the allergen which induced penicillin allergy commonly in clinic. METHODS: Penicillin, as a kind of hapten, was conjugated with carrier protein to form complete antigen and then was used to immunize BALB/c mice. Hybridoma cells secrecting mAb against penicillin were developed. Ascites from the immunized mice were purified by caprylic acid? ammonium sulfate precipitation. The specificity of the purified antibodies was detected and the suitable antibodies were used for establishing Sandwich ELISA. RESULTS: Nine hybridoma cells stably secrecting mAb were prepared through cell fusion, screening and cloning, and five of these purified mAb had relative high affinity. The double?antibody Sandwich ELISA for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established with a sensitivity of 870U/L.The average recovery rate was 107.81% and the average intra? and inter?coefficient of varitation (CV) was 6.7% and 9.3% respectively. The method was applied for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein from Group A Streptococcus Preparation. CONCLUSION: Nine hybridoma cell strains stably secreting mAb against benzylpenicillin were obtained. The double?antibody Sandwich ELISA for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established.

　　benzylpenicillin;benzylpenicilloyl;mAb;double?antibody Sandwich ELISA

　　 目的: 制備抗青霉素的單克隆抗體(mAb)并建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法, 對(duì)臨床上引起青霉素過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原青霉噻唑蛋白進(jìn)行研究。方法: 將半抗原青霉素和載體蛋白偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠, 應(yīng)用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細(xì)胞株。常規(guī)制備腹水, 用辛酸?硫酸銨法純化, 并對(duì)純化的mAb進(jìn)行特異性鑒定。通過(guò)對(duì)不同抗體組合的分析和條件的優(yōu)化, 建立檢測(cè)過(guò)敏原的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果: 經(jīng)細(xì)胞融合、 篩選及克隆化, 共獲得9株穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細(xì)胞株, 其中5株親和力較高。建立了雙抗體夾心ELISA相對(duì)定量檢測(cè)方法, 該方法靈敏度達(dá)到870U/L, 平均回收率為107.81%, 批內(nèi)變異系數(shù)平均為6.7%, 批間變異系數(shù)平均為9.3%, 可用于A群鏈球菌制劑中青霉噻唑蛋白的檢測(cè)。結(jié)論: 成功地制備了抗青霉素的mAb, 并建立了相對(duì)定量檢測(cè)青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法。

　　青霉素; 青霉噻唑基; 單克隆抗體; 雙抗體夾心ELISA

　　青霉素因其高效、 低毒的特點(diǎn)在臨床上被廣泛應(yīng)用, 但其結(jié)構(gòu)中的β?內(nèi)酰胺環(huán)很不穩(wěn)定, 在溶液狀態(tài)尤其是堿性條件下易開(kāi)環(huán)與蛋白、 多肽的氨基發(fā)生親核反應(yīng)生成穩(wěn)定的青霉噻唑蛋白, 形成臨床主要的過(guò)敏原。青霉素類抗生素的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率居各種藥物之首, 青霉素不純物0.01 μg即可使青霉素高度敏感者產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。生理?xiàng)l件下青霉素開(kāi)環(huán)后大約95%與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成青霉噻唑基（benzyl penicilloyl, BPO）主要抗原決定簇, 而其他一些共扼物如penicillanyl, penicillenate、 青霉烯酸、 penamaldate, penaldate, D?青霉胺和penicoyl等則為次要抗原決定簇, 后者僅占5%。理論上連接有兩個(gè)青霉噻唑基的蛋白、 多肽就可能與IgE分子形成橋式結(jié)構(gòu)從而引發(fā)I型超敏反應(yīng)。青霉素的這種不穩(wěn)定性使得在制備過(guò)程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能殘留有青霉噻唑蛋白, 而目前的檢測(cè)方法通常是針對(duì)游離的有抗菌活性的青霉素, 尚無(wú)專門(mén)針對(duì)具有免疫原性且有潛在致敏危險(xiǎn)的青霉噻唑蛋白的檢測(cè)方法。本研究中, 采用雜交瘤技術(shù)制備了穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細(xì)胞, 并建立了相對(duì)定量檢測(cè)青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法, 該方法特異性強(qiáng)、 靈敏度高, 有望對(duì)藥品、 食品中可能殘留的青霉噻唑蛋白進(jìn)行痕量檢測(cè)。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品, 為本所制備,相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為372.49, 純度為99.9%; 牛血清白蛋白（BSA）、 卵清蛋白（OA）、 多聚賴氨酸（Poly?L?Lysine, PLL）為Sigma公司產(chǎn)品; DMEM培養(yǎng)液為GibcoBRL公司產(chǎn)品, 新生牛血清購(gòu)自杭州四季清公司; HAT、 HT、 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、 Ig亞類試劑盒均購(gòu)自Sigma公司, PEG4000購(gòu)自Fluke公司, BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce公司, 所用二抗均為Jakson公司產(chǎn)品, 其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭�。Sp2/0細(xì)胞由本所細(xì)胞室提供, BALB/c 雌鼠（6~8周齡）由本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 完全抗原的制備 ①免疫原的制備:參照Haan的方法, 將25 mg青霉素鉀溶于pH9.6 Na2CO3緩沖液中, 充分混勻后加入5 mg牛血清白蛋白BSA（或卵清蛋白OA）, 調(diào)節(jié)pH值至11, 37℃攪拌過(guò)夜, 在0.01 mol/L PBS中充分透析至透析液中不再檢出有抑菌活性。將透析物分裝于-20℃保存。②篩選用包被抗原的制備: 用直鏈結(jié)構(gòu)的多聚賴氨酸（Poly?L?Lysine, PLL）與青霉素偶聯(lián)成BPO?PLL, 方法同①。

　　1.2.2 BALB/c小鼠的免疫 分別用兩種載體偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠, 每只20μg, 皮下多點(diǎn)及四腳掌初次免疫; 14 d后相同劑量腹腔加強(qiáng)免疫, 每2周加強(qiáng)1次, 加強(qiáng)后每隔7 d眼眶采血, 分別測(cè)定針對(duì)半抗原和載體蛋白的抗體效價(jià), 于細(xì)胞融合前3 d尾靜脈加強(qiáng)免疫。

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