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蒲公英多糖體外抑瘤和抗突變作用研究
蒲公英是中醫(yī)臨床常用的一種中草藥，下面是小編搜集整理的一篇關(guān)于蒲公英多糖體外抑瘤作用研究的論文范文，供閱讀參考。
【摘要】目的觀察蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制和抗突變作用。方法采用MTT法測(cè)定蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗突變作用。結(jié)果蒲公英多糖隨濃度的增加對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率增加，但不明顯;可以顯著提高外周血細(xì)胞免疫力，拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變(P<0.01)。結(jié)論蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用不明顯;能有效地拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變。
【關(guān)鍵詞】 蒲公英多糖 抑瘤 微核突變
蒲公英Taraxacum L.是中醫(yī)臨床常用的中草藥,具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋、健胃消炎、保肝利膽等功效[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英有抗菌[2]、抗突變[3]、抑瘤[4]、抗氧化[5]等多種藥理作用，并能提高機(jī)體免疫性，對(duì)抗環(huán)磷酰胺引發(fā)的DNA損傷[6]。蒲公英根部富含多糖[7]，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有廣泛的藥理作用，其中多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是目前研究的熱點(diǎn);同時(shí)外界環(huán)境誘發(fā)的突變是腫瘤細(xì)胞形成的重要因素之一。本文就蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制以及對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)的突變的拮抗作用進(jìn)行了研究。
1、材料與儀器
1.1 試劑PMI1640，美國(guó)GIBCO產(chǎn)品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品;環(huán)磷酰胺(CP)，上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品;噻唑蘭(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品;植物血凝素(PHA)，金爾康動(dòng)物藥業(yè)有限公司;DMSO，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Giemsa， Sigma公司產(chǎn)品。
1.2 材料東北蒲公英T.ohwianum Kitag.采自黑龍江省五大連池自然風(fēng)景區(qū)。蒲公英多糖的制備參照文獻(xiàn)[8]法進(jìn)行。肝癌細(xì)胞Bel-7402和正常人外周血淋巴細(xì)胞均由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。
1.3 儀器KHB全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ST-360)，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)箱，河北省虹宇儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;96孔板，Greiner公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)，ESCO公司產(chǎn)品。
2、方法
2.1 MTT法[9]檢測(cè)蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制作用運(yùn)用改良的MTT實(shí)驗(yàn)[9]計(jì)算蒲公英多糖對(duì)腫瘤的抑制作用，蒲公英多糖的終濃度為25，50，100，200，400，800，1 600，3 200 μg/ml。陽性對(duì)照加CP，終濃度為260 μg/ml;每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)平行孔。酶標(biāo)儀的吸收波長(zhǎng)采用570nm。
抑制率(IR)=(空白對(duì)照組OD值-多糖組OD值)/空白對(duì)照組OD值。采用SPSS數(shù)據(jù)包進(jìn)行方差分析。
2.2 微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蒲公英多糖拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變常規(guī)采人外周血與培養(yǎng)[10]。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將蒲公英多糖用PBS溶液配成溶液，微孔濾膜過濾(0.2 μm)。將多糖溶液加到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，使多糖濃度分別為50，200，800，3 200 μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每瓶?jī)?nèi)加入25 ml CP，使CP濃度達(dá)到100 μg/ml。另設(shè)空白對(duì)照組和CP陽性對(duì)照組，空白對(duì)照組加PBS不加CP，CP陽性對(duì)照組加CP不加多糖。制片采用文獻(xiàn)[10]法進(jìn)行。
統(tǒng)計(jì)：觀察計(jì)數(shù)1 000個(gè)可計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的微核(MN)數(shù)，計(jì)算千分率(MN‰)。用SPSS軟件包分析各組數(shù)據(jù)。抑制率(%)=(陽性組MN數(shù)-實(shí)驗(yàn)組MN數(shù))×100/陽性組MN數(shù)。
3、結(jié)果
3.1 蒲公英多糖體外抑瘤作用蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的細(xì)胞毒作用見表1。結(jié)果顯示，隨著蒲公英多糖濃度的增大，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用也在增大，即蒲公英多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在量依賴關(guān)系。但是即使在很大的濃度下(3 200 μg/ml)，多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率僅為27.94%，而此時(shí)蒲公英多糖溶液中已出現(xiàn)很少量的不溶解的多糖，因此，多糖的實(shí)際濃度未能達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平。而CP在較低濃度(260 μg/ml)下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用就已經(jīng)很顯著了(IR>30%)。一般認(rèn)為，只有當(dāng)抑制率達(dá)到30%以上才說明腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感[11]，蒲公英多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的最大抑制率小于30%，故認(rèn)為蒲公英多糖對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402沒有明顯的抑制作用。表1 蒲公英多糖對(duì)Bel-7407的抑制作用(略)
3.2 蒲公英多糖拮抗CP誘發(fā)的微核突變CP是一種烷化劑，是臨床常用的免疫抑制劑，能夠抑制細(xì)胞的增殖，常做抗癌藥物;同時(shí)它對(duì)正常細(xì)胞DNA的合成及分裂具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而明顯誘發(fā)微核產(chǎn)生。由表2可知，陽性對(duì)照組(CP組)與空白對(duì)照組的微核率相差極為顯著(P<0.01)。蒲公英多糖對(duì)CP誘發(fā)的微核突變有明顯的抑制作用，細(xì)胞微核率與CP對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，并且實(shí)驗(yàn)各組的抑制作用呈劑量效應(yīng)。由此可見，蒲公英多糖對(duì)CP誘發(fā)的外周血淋巴細(xì)胞微核突變有很顯著的拮抗作用，說明蒲公英多糖對(duì)遺傳物質(zhì)具有保護(hù)作用，即抗突變作用。表2 蒲公英多糖對(duì)CP誘發(fā)微核的拮抗作用(略)
4、討論
本實(shí)驗(yàn)表明，蒲公英多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在著劑量效應(yīng)，但是抑制作用不明顯。抑制作用不明顯可能是由于以下幾種原因：①應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選有周期短、結(jié)果顯而易見的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著一定的局限性，主要表現(xiàn)在：假陰性結(jié)果導(dǎo)致有效藥物的漏篩。有些藥物如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑需要通過機(jī)體的反應(yīng)才能對(duì)細(xì)胞起作用，有些藥物必須經(jīng)過體內(nèi)酶的代謝活化才能變成活性成分，此類藥物在進(jìn)行體外篩選時(shí)就會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果，從而導(dǎo)致有效藥物的漏選，因此，體外試驗(yàn)的結(jié)果必須通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。②本實(shí)驗(yàn)所用蒲公英多糖為熱水浸提法獲得，提取過程中采用80℃，這個(gè)溫度會(huì)不會(huì)破壞多糖的生物活性尚未可知;并且所用的多糖為精制粗多糖，沒有經(jīng)過純化，其中的微量蛋白質(zhì)等成分可能對(duì)細(xì)胞的增殖有影響;或者不同分子量的多糖對(duì)腫瘤的作用也不相同，它們的相互作用使得蒲公英多糖的抑瘤效果不顯著。③蒲公英多糖的抑瘤作用有可能是通過提高機(jī)體免疫功能而發(fā)揮作用。
蒲公英多糖可以有效拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變，保護(hù)DNA不受損傷。雖然蒲公英多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有直接抑制作用，但是也說明了蒲公英多糖對(duì)細(xì)胞沒有毒害作用，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，在臨床上不會(huì)由于使用蒲公英多糖而帶來對(duì)機(jī)體的副作用�？梢栽O(shè)想，在臨床上將蒲公英多糖與抑瘤藥物配合使用，既增強(qiáng)了藥物的抑瘤作用，又可以有效保護(hù)正常細(xì)胞不受損傷，這將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)行探索。
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