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苗藥痛風停對SD大鼠急性痛風性關節(jié)炎的影響
【摘 要】目的：觀察苗藥痛風停對尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠急性痛風性關節(jié)炎的關節(jié)腫脹度、步態(tài)分級、滑膜病理、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響，探討苗藥痛風停對急性痛風性關節(jié)炎的作用機制。方法：將60只SD大鼠隨機分為空白對照組，苗藥痛風停低、中、高劑量組，雙氯芬酸鈉組，模型對照組，每組10只。除空白對照組外，其余分別建立以尿酸鹽結晶誘導的大鼠急性痛風性關節(jié)炎模型，分別觀察和測量造模前及造模后6，12，24，48 h大鼠關節(jié)橫徑，并計算關節(jié)腫脹度;觀察大鼠24，48 h步態(tài)分級;造模后48 h處死大鼠，用酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。結果：各治療組對大鼠關節(jié)腫脹度、步態(tài)分級、滑膜病理改變和IL-1β、IL-6、TNF-α的表達有不同程度的改善，苗藥痛風停中、高劑量組與雙氯芬酸鈉組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。結論：苗藥痛風停能夠改善尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠急性痛風性關節(jié)炎關節(jié)腫脹度、步態(tài)分級及滑膜病理改變;苗藥痛風停降低尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達，以中、高劑量作用明顯，并呈劑量依賴性。
【關鍵詞】 痛風性關節(jié)炎;細胞因子;苗藥痛風停;尿酸鹽;實驗研究
痛風(gout)是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂及/或排泄減少導致尿酸鹽(monosodium urate，MSU)沉積所引起的晶體性關節(jié)病。痛風在我國的患病率約為0.15%～0.67%，較以前有明顯升高[1]。痛風性關節(jié)炎常常合并有心血管疾病、高血壓、2型糖尿病、肥胖、高脂血癥、代謝綜合征、慢性腎臟疾病和腎結石等[2]，而這些合并癥往往是NSAIDs和/或秋水仙堿常見的禁忌癥[3]。細胞因子白細胞介素IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等的高表達可導致、加重MSU結晶誘導的急性炎癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。中醫(yī)學對痛風治療有深入的認識，積累了豐富的臨床經(jīng)驗。苗藥痛風停根據(jù)中醫(yī)理論和苗醫(yī)理論對痛風認識的結合而遣方組藥，由白虎加桂枝湯加減苗藥組成，通過本課題組多年臨床觀察、臨床研究和實驗研究，其治療急性痛風性關節(jié)炎療效顯著，安全性好，緩解痛風性關節(jié)炎效果明顯，并具有降尿酸作用[5-7]。在前期實驗研究中，筆者已經(jīng)證實苗藥痛風停能夠抑制SD大鼠急性痛風性關節(jié)炎IL-8、環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達，減輕關節(jié)滑膜炎癥[8-9]。本文旨在探討苗藥痛風停對IL-1β、IL-6和TNF-α的影響。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 清潔級健康雌雄SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由重慶滕鑫生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2014-0009。
1.2 主要試劑及儀器 尿酸鈉(美國Sigma公司，批號BCBH7155V);吐溫80(美國Amresco公司，批號20090120);多粘菌素B(美國Amresco公司，批號2013105156);氨基酸乙脂(上海伊卡生物技術有限公司，批號EK131219);質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液(上海博谷生物科技有限公司，批號PT028);IL-1β ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30419R);IL-6 ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30646R);TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30635R);酶標儀(美國BioTek有限公司，批號Synergy TM);顯微鏡(日本OLYMPUS公司，批號BX51T-PHD-J11);CMOS(日本OLYMPUS公司，批號BX51T-PHJ-D17);切片機(德國Leica公司，批號RM2015);冷凍離心機(北京離心機廠，批號LDZ5-2型);電子天平(瑞士METTER，批號AE100型);低溫冰箱(日本SANYO公司，批號MDF-382E型);電子游標卡尺：貴陽中醫(yī)學院基礎實驗室提供。
1.3 實驗藥物 苗藥痛風停由生石膏15 g、知母12 g、黃柏12 g、川萆薢10 g、薏苡仁12 g、砂仁12 g、川牛膝15 g、甘草6 g等，加苗藥觀音草12 g、芭蕉根12 g、絡石藤15 g、大血藤15 g等組成。以上生藥均購于貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院。取上藥煎湯濃縮，質(zhì)量分數(shù)按實驗需求的低、中、高分組分別濃縮至1.54，3.08，6.16 g・mL-1，置于4 ℃冰箱保存。雙氯芬酸鈉緩釋片(四川花新制藥有限公司，批號H19991402)，臨用時將藥片充分研磨后用無菌蒸餾水配制成混懸液，然后配制成1.54 mg・mL-1的混懸液備用。
2 方 法
2.1 實驗動物分組 將60只SD大鼠隨機分為空白對照組，苗藥痛風停低、中、高劑量組，雙氯芬酸鈉組，模型對照組，每組10只。
2.2 造模方法 將大鼠步態(tài)分級[10-11]作為各組SD大鼠的篩選標準，未達到0級標準的SD大鼠則剔除不用。具體造模方法：依據(jù)Mc Carty DJ[12]的經(jīng)典造模方法，先用質(zhì)量分數(shù)為20%的烏拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉，然后常規(guī)消毒大鼠右側膝關節(jié)皮膚，稍彎曲膝關節(jié)，從關節(jié)正中或側方用6號注射針進針，將尿酸鈉溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10 U・mL-1)注入大鼠膝關節(jié)腔，空白對照組予相同劑量的生理鹽水關節(jié)腔注射。整個實驗過程中，有3只大鼠因灌胃不當死亡，2只大鼠因麻醉過深死亡，為保證樣本數(shù)量，及時填補。
2.3 給 藥 各組SD大鼠在相同條件下自由飲食1周后，開始灌胃。根據(jù)成人與大鼠用藥等效劑量換算，中劑量等于將成人用藥劑量換算為大鼠用藥劑量，中劑量減半則為低劑量，中劑量加倍則為高劑量。苗藥痛風停低、中、高劑量組分別按質(zhì)量分數(shù)不同每只灌胃2 mL，即低、中、高劑量組分別為每只1.54，3.08，6.16 g・d-1;雙氯芬酸鈉組灌胃劑量每只2 mL，即每只2.08 mg・d-1;空白對照組及模型對照組予以等體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠連續(xù)灌胃3 d及造模前1 h進行灌胃，每日1次。最后一次灌胃后1 h，按上述造模方法造模。造模后繼續(xù)給藥，每日1次，直至大鼠處死。
2.4 標本取材 將大鼠用質(zhì)量分數(shù)為20%的烏拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉后，股動脈放血約4～6 mL，靜置約1 h后，以2500 r・min-1速度離心30 min，分離血清，用于ELISA檢測。大鼠放血后，將其處死，進行常規(guī)消毒，沿后肢右膝關節(jié)正中縱行剪開皮膚，暴露出膝關節(jié)，打開膝關節(jié)腔，用眼科剪取完整的關節(jié)滑膜組織，用PBS水清洗去除血跡后，置于1.5 mL預冷的離心管中，然后加用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛約1 mL固定，迅速凍存在-80 ℃冰箱中。
2.5 檢測指標 關節(jié)腫脹度：分別于造模前，造模后6，12，24，48 h用電子游標卡尺在同一部位測定膝關節(jié)橫徑，造模前后的差值作為關節(jié)腫脹度。大鼠步態(tài)分級：按Coderre等[11]的方法觀察大鼠步態(tài)，0級，正常;1級，輕微跛行，受試下肢略有彎曲;2級，中度跛行，受試下肢剛觸及地面;3級，重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走。在造模后12，24 h評價大鼠步態(tài)分級。病理學檢測采用HE染色，先用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定組織，石蠟包埋、切片。HE染色的主要步驟如下：先用二甲苯脫蠟，無水乙醇水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色;之后用酒精將伊紅洗掉，以酒精梯度脫水中性樹膠封片后光鏡下觀察滑膜組織病理變化。ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(具體操作方法按說明書進行)。
2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，如果符合正態(tài)分布和方差齊性，不同組間比較采用One-Way ANOVA分析;方差齊性時用LSD法檢驗，方差不齊性時用Tamhance's T2法檢驗;如果不符合正態(tài)分布，則使用非參數(shù)檢驗;等級資料采用Kruskal-Wallis H及Mann-Whitney U檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3 結 果
3.1 各組大鼠關節(jié)腫脹度比較 造模后6 h，與空白對照組比較，各組關節(jié)腫脹度均不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。造模后12 h，與空白對照組比較，各組關節(jié)腫脹度繼續(xù)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與模型對照組比較，各治療組關節(jié)腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與雙氯芬酸鈉組比較，苗藥痛風停低、中、高劑量組關節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。造模后24 h，各組關節(jié)腫脹度繼續(xù)升高，其中模型對照組關節(jié)腫脹度達到最高峰，與空白對照組比較，各組關節(jié)腫脹度差異均有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與模型對照組比較，各治療組關節(jié)腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與雙氯芬酸鈉組比較，苗藥痛風停中、高劑量組關節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);苗藥痛風停低劑量組關節(jié)腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。之后各組大鼠關節(jié)腫脹開始下降，造模后48 h，模型對照組關節(jié)腫脹度繼續(xù)下降，與空白對照組比較，差異仍有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與模型對照組比較，雙氯芬酸鈉組，苗藥痛風停中、高劑量組關節(jié)腫脹度下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)，苗藥痛風停低劑量組關節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與雙氯芬酸鈉組比較，苗藥痛風停中、高劑量組關節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與苗藥痛風停高劑量比較，中劑量組關節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與苗藥痛風停低劑量組比較，中劑量組關節(jié)腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。見表1。 3.2 各組大鼠步態(tài)分級比較 大鼠步態(tài)分級統(tǒng)計采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗，造模后24 h，觀察各組大鼠步態(tài)，總體樣本差異有統(tǒng)計學意義(χ2 = 29.800，P < 0.01);與空白對照組比較，各造模組差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與模型對照組比較，各治療組差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);各治療組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。經(jīng)造模后48 h，總體樣本差異無統(tǒng)計學意義(χ2 = 5.102，P > 0.05)，說明48 h后各組大鼠跛行步態(tài)逐漸緩解。見表2。
3.3 滑膜組織病理學形態(tài)改變 HE染色后，空白對照組關節(jié)滑膜組織光滑完整、無增生，可見少量炎性細胞浸潤、無血管增生及纖維素滲出;苗藥痛風停各劑量組及雙氯芬酸鈉組滑膜組織充血水腫，成纖維細胞增生，炎性細胞浸潤減少，程度比模型對照組減輕;模型對照組滑膜充血水腫、周圍毛細血管擴張，大量炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞�；げ±韺W顯示，苗藥痛風停不同劑量均能減輕滑膜組織充血水腫及毛細血管擴張，炎性細胞浸潤，減輕滑膜病理損害，從而減輕炎癥反應。見圖1。
3.4 各組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達情況 ELISA檢測結果顯示，IL-1β、IL-6和TNF-α表達量均增高，與空白對照組比較，模型對照組差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與模型對照組比較，各治療組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量均有下降，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01);與雙氯芬酸鈉組比較，苗藥痛風停中、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與苗藥痛風停高劑量組比較，中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)，低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。見表3。
4 討 論
IL-1β是最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)劑，是調(diào)節(jié)炎癥的始動因素，在痛風性關節(jié)炎中，活化的IL-1β能調(diào)節(jié)其他細胞因子和炎癥趨化因子，募集中性粒細胞進入MSU結晶沉積部位，放大炎癥反應，從而加重關節(jié)炎癥[13]。IL-1β是痛風性關節(jié)炎發(fā)病過程中的關鍵因子，在急慢性痛風性關節(jié)炎中起重要作用，對痛風性關節(jié)炎的形成和關節(jié)破壞發(fā)揮重要作用[14]，采用IL-1抑制劑治療痛風性關節(jié)炎取得了滿意的臨床療效[15]。IL-6也參與了痛風的發(fā)生發(fā)展，當痛風性關節(jié)炎等病情活動或關節(jié)破壞嚴重時，血清與關節(jié)液中IL-6的水平升高，IL-6作為判斷痛風性關節(jié)炎疾病活動性和嚴重程度的指標[16]。MSU晶體使滑膜細胞和單核細胞生成IL-6增加。最新研究顯示，托珠單抗治療痛風性關節(jié)炎后患者血清IL-6降低，痛風石大小有所減小，不發(fā)熱，在此過程中患者沒有急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)作[17]。TNF-α是炎性細胞因子網(wǎng)鏈中的第1個細胞因子，不僅啟動炎癥反應，而且能誘導其他細胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥細胞因子的過度表達，導致炎癥反應進一步擴大[18]。在MSU晶體誘導的痛風模型中，如果阻斷TNF-α的產(chǎn)生，則E-選擇素的表達和中性粒細胞的募集明顯地受到抑制，證明了TNF-α在痛風性關節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。TNF-α抑制劑對于復雜的痛風性關節(jié)炎能夠有效緩解臨床癥狀，并且抑制MSU的繼續(xù)沉積[19]。中醫(yī)學認為，痛風的發(fā)病機制主要是飲食不節(jié)，過食肥甘厚味、辛辣之品，加上外感風寒濕邪氣，損傷脾胃，脾失健運，濕濁內(nèi)滯，聚于關節(jié)，濕聚成痰，痰濕為有形之邪，痹阻日久，氣血運行不暢，則生瘀血，痰濕與瘀血互結阻滯臟腑經(jīng)絡氣血津液運行，機體代謝紊亂，則發(fā)為痛風。痰濕與瘀血互結則痛風長期不愈，反復發(fā)作。苗醫(yī)認為，疾病是由不良的生存環(huán)境、季節(jié)氣候因素和外來毒素(如風毒、氣毒、寒毒、水毒)等引起人體的損傷。苗藥痛風停由經(jīng)方白虎加桂枝湯加減苗藥觀音草、芭蕉根、絡石藤、大血藤等組成，綜觀全方共奏清熱解毒、健脾利濕、活血化瘀之效。
本實驗采用ELISA檢測顯示，與空白對照組比較，模型對照組差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)，說明造模是成功的，各治療組IL-1β、IL-6和TNF-α表達均有所下降，以苗藥痛風停中、高劑量組顯著。各造模組大鼠關節(jié)腫脹度在造模后6 h開始腫脹，12 h后繼續(xù)升高，24 h達到高峰，48 h后逐漸緩解，在造模后12 h，各治療組關節(jié)腫脹明顯低于模型對照組(P < 0.01)，在24 h和48 h分別表現(xiàn)出以苗藥痛風停中、高劑量組緩解明顯。而各組大鼠步態(tài)分級則以24 h模型對照組明顯，出現(xiàn)中、重度跛行，各治療組跛行程度較輕，48 h后基本緩解，苗藥痛風�？擅黠@緩解大鼠關節(jié)腫脹度和步態(tài)分級。通過病理學觀察顯示，各治療組滑膜組織充血、水腫，炎癥細胞浸潤較模型對照組減輕，說明苗藥痛風停能夠改善滑膜病理損害，減輕炎癥反應。綜上所述，筆者推測苗藥痛風停對MSU誘導的SD大鼠急性痛風性關節(jié)炎的改善可能是通過抑制下游細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達減輕炎癥反應而實現(xiàn)的，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。
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