青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌吡嗪酰胺耐藥基因pncA的檢測(cè)

　　【摘要】 目的 了解青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌耐吡嗪酰胺(PZA)分離株pncA基因突變的情況，探討其與耐PZA之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)76例結(jié)核分支桿菌臨床分離株進(jìn)行結(jié)核分支桿菌常規(guī)培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)，聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)技術(shù)檢測(cè)pncA基因的突變。結(jié)果 76株結(jié)核分支桿菌臨床分離株均經(jīng)PCR擴(kuò)增出結(jié)核分支桿菌復(fù)合群保守序列IS6110基因片段，69株擴(kuò)增出pncA基因的特異序列。后者包括：SSCP泳動(dòng)異常者18株，其中耐藥株13株，敏感株5株;SSCP泳動(dòng)正常者51株，其中耐藥株14株，敏感株37株。結(jié)論 青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐PZA主要分子機(jī)制之一為pncA基因的突變;PCRSSCP技術(shù)能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分支桿菌耐PZA基因pncA 的突變，可彌補(bǔ)常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足。

　　【關(guān)鍵詞】 分支桿菌 結(jié)核 基因 pncA BACTEC培養(yǎng)方法 聚合酶鏈反應(yīng) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis, the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC460 system, and the mutations of pncA gene detected by PCRSSCP.ResultsAmong the 76 isolates, 44 strains were PZAsensitive and 32 PZAresistant by　the BACTEC460 system. With PCRSSCP, 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile, in which, 13 were PZAeresistant and five PZAsensitive. Fiftyone strains displayed normal pncA SSCP profile, in which 14 were PZAresistant and 37 PZAsensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamideresistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCRSSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis, preferable to the routine drugsusceptibility test.

　　[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; genes, pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; singlestrand conformation polymorphism

　　近年來(lái),結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性明顯回升趨勢(shì)，其主要原因之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的涌現(xiàn)。目前對(duì)結(jié)核分支桿菌耐藥分子機(jī)制的研究主要集中在各種藥物的作用靶位及其相關(guān)基因的突變位點(diǎn)上。吡嗪酰胺(PZA)自1949年首次用于肺結(jié)核治療以來(lái)，作為第一線抗結(jié)核藥物應(yīng)用已有50多年的歷史。近幾年結(jié)核分支桿菌臨床分離株對(duì)其耐藥趨勢(shì)日漸上升，并且呈現(xiàn)與異煙肼和利福平同時(shí)耐藥的現(xiàn)象[1]。然而，目前對(duì)PZA的作用機(jī)制及耐藥分子機(jī)制尚不清楚。本文應(yīng)用BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核分支桿菌常規(guī)培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)，聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(PCRSSCP)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌pncA基因，旨在了解青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌耐PZA分離株的pncA基因突變情況，探討其與耐PZA之間的關(guān)系,以建立新的、快速有效的結(jié)核分支桿菌藥敏試驗(yàn)方法，彌補(bǔ)常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足。

　　1 材料和方法

　　1.1 標(biāo)本來(lái)源

　　76例結(jié)核分支桿菌臨床分離株來(lái)自青島市結(jié)核肺病防治研究所2002年1～12月診治的肺結(jié)核病人。其中初治病人60例，復(fù)治病人16例;男43例，女33例;年齡21～83歲，平均52歲。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)試劑購(gòu)自BECTONDICKINSON公司，dNTP、 TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均購(gòu)自Promega公司，PCR擴(kuò)增儀為PE公司480型。

　　1.3 痰標(biāo)本的處理及PZA藥敏試驗(yàn)

　　根據(jù)文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。痰標(biāo)本經(jīng)消化、離心，接種至含有C14棕櫚酸的12B培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。第1周上機(jī)檢測(cè)生長(zhǎng)指數(shù)(GI)值2～3次，以后每周測(cè)定1次，至第6周。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：GI值0～10，培養(yǎng)陰性;GI值11～50，培養(yǎng)陽(yáng)性;GI值51～100，可進(jìn)行結(jié)核分支桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分支桿菌鑒定;GI值500～800，可進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

　　結(jié)核分支桿菌陽(yáng)性標(biāo)本一部分提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?另一部分在12B培養(yǎng)基內(nèi)加入定量PZA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)以蒸餾水代替PZA作為對(duì)照。按以下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：對(duì)照組的生長(zhǎng)指數(shù)(AGI) 值>測(cè)試組的生長(zhǎng)指數(shù)(△GI)值為敏感;AGI值<△GI值為耐藥;AGI值=△GI值為臨界。

　　1.4 PCR檢測(cè)結(jié)核分支桿菌IS6110及pncA基因

　　1.4.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gene Bank中結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv全基因序列,利用DNAStar軟件分別設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于結(jié)核分支桿菌復(fù)合群保守序列IS6110及pncA基因序列的 PCR引物。其中引物INS1和INS2擴(kuò)增IS6110基因，引物pncA1和pncA2擴(kuò)增pncA基因。引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。引物由上海生工生物公司合成(PAGE純化)，純水稀釋分裝，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 取經(jīng)BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)陽(yáng)性的增菌液1.5 mL于無(wú)菌干燥玻璃試管中，酚氯仿法提取DNA。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。表1 引物序列及其產(chǎn)物

　　1.5 PCRSSCP分析

　　pncA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后經(jīng)80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后可見(jiàn)野生型的單鏈DNA與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的單鏈DNA位于同一位置，而突變型的單鏈DNA低于或高于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的單鏈DNA水平，以此來(lái)確定突變例數(shù)。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)

　　從130份臨床痰標(biāo)本中共檢出76株結(jié)核分支桿菌，陽(yáng)性率為58.5%。其中對(duì)PZA敏感44株，耐藥32株，耐藥率為42.1%。

　　2.2 PCR擴(kuò)增

　　本文76株結(jié)核分支桿菌臨床分離株均擴(kuò)增出IS6110基因(245 bp)的目的條帶，與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株一致，表明這些臨床分離株均為結(jié)核分支桿菌。69株擴(kuò)增出pncA基因的特異序列(254 bp)。7株未檢出pncA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，其中耐藥5株，敏感2株(圖1)。

　　2.3 PCRSSCP檢測(cè)結(jié)核分支桿菌pncA基因突變的結(jié)果

　　以結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為對(duì)照，69株結(jié)核分支桿菌臨床分離株中，SSCP泳動(dòng)異常者18株，其中耐藥13株，敏感5株;泳動(dòng)正常者51株，其中耐藥14株，敏感37株(圖2)。

　　2.4 PCRSSCP與BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

　　BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，低度耐藥有8株SSCP泳動(dòng)異常，13株SSCP泳動(dòng)正常;高度耐藥有5株SSCP泳動(dòng)異常，1株 SSCP泳動(dòng)正常。PZA耐藥株pncA基因突變率為48.1%(13/27)，PZA敏感株pncA基因突變率為11.9%(5/42)。 BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)PZA藥敏結(jié)果與PCRSSCP基因突變分析結(jié)果比較，差異無(wú)顯著性(χ2=3.37,P>0.05)。見(jiàn)表2。表 2 BACTEC460 PZA藥敏結(jié)果與PCRSSCP分析結(jié)果的比較

　　3 討 論

　　目前我國(guó)結(jié)核分支桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠涂片染色鏡檢和結(jié)核桿菌的培養(yǎng)與鑒定。

　　痰標(biāo)本涂片染色鏡檢法簡(jiǎn)單、快速，是臨床常規(guī)開(kāi)展的方法，但敏感性較低，只能作為篩選。傳統(tǒng)的藥敏方法依靠直接或間接的含藥培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分支桿菌的藥敏鑒定，僅能反映體外耐藥性的程度。由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用培養(yǎng)基不同，檢測(cè)方法不同，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不一，導(dǎo)致報(bào)道結(jié)果差異。而且由于結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)緩慢，需較長(zhǎng)時(shí)間方能獲得結(jié)果，耗時(shí)太長(zhǎng)，因而不能滿(mǎn)足臨床需要[3]。

　　BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)是利用分支桿菌能夠分解C14棕櫚酸，產(chǎn)生14CO2的原理，自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)液中14CO2含量，并換算成GI值，由GI值的高低來(lái)判斷是否有細(xì)菌的生長(zhǎng)。此種方法不僅提高了檢出率和分離速度，而且大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性率為58.5%。但由于此方法仍建立在細(xì)菌培養(yǎng)基礎(chǔ)上，結(jié)果回報(bào)日期仍較長(zhǎng)，加之儀器價(jià)格昂貴，又具有放射性污染，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用，也不能滿(mǎn)足現(xiàn)代短程化療需要。由于PZA藥敏試驗(yàn)需在酸性條件下(pH 5.0～5.5)進(jìn)行，常用的改良羅氏培養(yǎng)基不能用于PZA藥敏試驗(yàn);BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)PZA藥敏試驗(yàn)也需用特殊的酸性液體培養(yǎng)基，費(fèi)用較高，長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)開(kāi)展PZA藥敏常規(guī)試驗(yàn)的單位很少，也缺乏統(tǒng)一的方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。

　　目前，結(jié)核分支桿菌的耐藥機(jī)制及耐藥的分子基礎(chǔ)大部分已被闡明，建立了多種快速檢測(cè)結(jié)核分支桿菌耐藥基因型的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。PCRSSCP操作簡(jiǎn)單、快速，2 d內(nèi)即可獲得測(cè)定結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備和試劑，無(wú)放射性污染，無(wú)需限制性?xún)?nèi)切酶，可直接對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)分析確認(rèn)單鏈突變位點(diǎn)，并且檢出率相對(duì)較高，已成為目前應(yīng)用最廣泛的突變檢測(cè)技術(shù)之一。

　　結(jié)核分支桿菌對(duì)PZA耐藥性的產(chǎn)生，大量資料主要集中于對(duì)PZA酶的編碼基因pncA的研究。目前認(rèn)為pncA基因突變，使PZA酶活性降低或消失，不能將PZA轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕�，從而�?dǎo)致結(jié)核分支桿菌對(duì)PZA產(chǎn)生耐藥。pncA基因全長(zhǎng)561 bp。其突變分布比較廣泛，可分布在啟動(dòng)子區(qū)域和結(jié)構(gòu)基因的各個(gè)位置。SCORPIO等[4]對(duì)9株P(guān)ZA耐藥菌株進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果9株的SSCP 帶譜與藥物敏感菌株有差異，特異性100%。SREEVATSAN等[5]檢測(cè)了67株耐PZA分離株，72%有pncA基因突變。HOU等[6]應(yīng)用 SSCP和DNA測(cè)序分析35株P(guān)ZA耐藥菌株，32株有核苷酸的替代、插入和缺失，pncA突變率高達(dá)91.4%。國(guó)內(nèi)吳雪瓊等[7]利用 PCRSSCP分析74株結(jié)核分支桿菌臨床分離株的pncA基因，32株P(guān)ZA敏感株SSCP未發(fā)現(xiàn)異常，22株P(guān)ZA耐藥株10株SSCP異常，pncA基因突變率為46%，進(jìn)一步測(cè)序發(fā)現(xiàn)有58位和68位密碼子改變。李洪敏等[8]檢測(cè)了134例臨床耐5種藥物(PZA、鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇)分離株，對(duì)其中96株耐PZA分離株通過(guò)PCRSSCP技術(shù)進(jìn)行分析，高耐藥株有35株出現(xiàn)泳動(dòng)變位，低耐藥株有6株出現(xiàn)泳動(dòng)變位，耐 PZA分離株總突變率為42.7%。王巍等[9]應(yīng)用PCRSSCP方法分析117例老年結(jié)核病人，pncA基因突變率為41.0%。

　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，27株P(guān)ZA pncA基因擴(kuò)增陽(yáng)性的耐藥分離株中，13株SSCP帶譜存在泳動(dòng)異常,pncA基因突變率為48.1%(13/27)。比上述國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)結(jié)果略高，但顯著低于國(guó)外文獻(xiàn)結(jié)果�？梢�(jiàn)pncA基因的突變是本地區(qū)結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐PZA的主要分子機(jī)制之一。據(jù)報(bào)道，72%～94%的PZA耐藥菌株中可見(jiàn) pncA基因的丟失、插入或替代[1，6，10]。pncA基因突變的特點(diǎn)不一，是否與地理區(qū)域有關(guān)，尚需進(jìn)一步探討。耐藥菌株中有14株SSCP帶譜與 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株相同，提示這14株耐藥菌株的耐藥性可能有其他的機(jī)制，如可能因?yàn)檫拎核嵩诰�體內(nèi)轉(zhuǎn)移，也可能由于pncA基因的突變不足以引起單鏈 DNA空間構(gòu)象的改變[11，12]。PZA敏感菌株中有5株SSCP泳動(dòng)異常，文獻(xiàn)[13，14]也有類(lèi)似報(bào)道，可能為一些沉寂突變，還需進(jìn)一步用 DNA測(cè)序來(lái)證明。

　　BACTEC培養(yǎng)系統(tǒng)藥敏結(jié)果與PCRSSCP分析結(jié)果在判斷結(jié)核分支桿菌耐藥性方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這兩種方法在檢測(cè)PZA耐藥性方面結(jié)果一致。由于PCRSSCP分析方法2 d內(nèi)即可獲得測(cè)定結(jié)果，因此可用于快速檢測(cè)結(jié)核分支桿菌PZA藥敏試驗(yàn)，彌補(bǔ)了常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足。但此方法特異性不高，在臨床推廣應(yīng)用有一定局限性。

　　總之，青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐PZA的主要分子機(jī)制之一為pncA基因的突變。PCRSSCP技術(shù)可快速較準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分支桿菌耐PZA基因pncA的突變，彌補(bǔ)了常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足。

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