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土霉素片微生物檢查方法的驗證
【論文關(guān)鍵詞】土霉素片；微生物限度檢查法
【論文摘要】目的：建立土霉素片的微生物限度檢查方法。 方法：采用薄膜過濾法對土霉素片處理后，分別進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證。結(jié)果：金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。結(jié)論：土霉素片采用薄膜過濾法檢查微生物限度方法成立。
Terramycin piece microorganism inspection method confirmation Wang Yanning Guo Lingbo?
【Abstract】Objective:Establishment terramycin piece microorganism limit inspection method. Method: Uses the thin film to filter the law after terramycin piece processing, separately carries on the bacterium, the mold and the saccharomycetes counts the method confirmation.Result：The golden yellow staphylococcus and the white rosary fungus returns-ratio is bigger than 70%. Conclusion: The terramycin piece uses the thin film to filter the law inspection microorganism limit method to be tenable.?
【Key words】Terramycin piece; Microorganism limit inspection method
土霉素是四環(huán)素類抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位結(jié)合，抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質(zhì)的合成，對細菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法，而應(yīng)采用薄膜過濾法消除其抑菌作用后再檢查。
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1.1 儀器：HWS-250型恒溫恒濕箱（天津蘇瑞科技開發(fā)有限公司），集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），薄膜（孔徑0．22um），康氏振蕩器。
1.2 試劑：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等，均由中國品生物制品檢定所提供。
1.3 菌種：陽性對照菌：金黃色葡萄球菌（驗證細菌）、白色念珠菌（驗證酵母菌、霉菌）；陰性對照：金黃色葡萄球菌（驗證大腸埃希菌）。所用菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供；稀釋劑及沖洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
1.4 樣品：土霉素片［0.25g（25萬單位）］，廠家為河南華利藥業(yè)有限責任公司，批號為07070601。
2 方法與結(jié)果
2.1 細菌、霉菌、酵母菌檢查方法驗證。
2.1.1 細菌檢測方法驗證。
2.1.1.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
2.1.1.2 菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
2.1.1.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
2.1.1.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第3次沖洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
2.1.1.5 上述試驗連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
金黃色葡萄球菌計數(shù)后平均值：?
稀釋劑對照組菌數(shù)：第一次47個，第二次53個，第三次49個；?
菌液組菌數(shù)：第一次58個，第二次64個，第三次60個；?
試驗組菌數(shù)：第一次45個，第二次54個，第三次46個；?
供試品對照組菌數(shù)：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
2.1.1.6 計算金黃色葡萄球菌回收率。
2.1.1.6.1 稀釋劑對照組的回收率:(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：47/58×100%=81.0% ?
第二次: 53/64×100%=82.8%?
第三次: 49/60×100%=81.7%
2.1.1.6.2 試驗組的回收率:?
[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%?
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%?
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
2.1.2 霉菌、酵母菌檢查方法驗證。
2.1.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
2.1.2.2 菌液組：取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
2.1.2.3 供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
2.1.2.4 稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第三次沖洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
2.1.2.5 上述試驗連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
白色念珠菌計數(shù)后平均值：?
稀釋劑對照組菌數(shù)：第一次56個，第二次60個，第三次53個；?
菌液組菌數(shù)：第一次45個，第二次47個，第三次42個；?
試驗組菌數(shù)：第一次43個，第二次45個，第三次44個；?
供試品對照組菌數(shù)：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
2.1.2.6 計算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀釋劑對照組的回收率:
(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：45/56×100%=80.4%?
第二次: 47/60×100%=78.3%?
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 試驗組的回收率:
[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%?
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%?
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大腸埃希菌檢測方法驗證。
2.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)/分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第三次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml，薄膜過濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中, 35℃培養(yǎng)24小時,取0.2ml上述培養(yǎng)物加入5ml MUG培養(yǎng)基中,24小時后,加靛基質(zhì)試液5滴,液面呈現(xiàn)玫瑰紅環(huán)。
2.2.2 陰性菌對照組：照上述方法操作，第三次沖洗時沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過濾，取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24小時，再取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，于35℃培養(yǎng)24小時，未發(fā)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌典型菌落。
3 討論
3.1 在細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證三次平行試驗中，稀釋劑對照菌回收率均不低于70%，試驗組的菌回收率均不低于70%，照薄膜過濾法可進行土霉素片的細菌、霉菌及酵母菌的檢查。
3.2 通過大腸埃希菌檢測方法驗證，陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出大腸埃希菌，按薄膜過濾法可進行土霉素片的大腸埃希菌檢查。
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