放射性碘標記羥氨芐青霉素用于青霉素結(jié)合蛋白的研究

時間：2024-07-30 08:10:17 藥學(xué)畢業(yè)論文我要投稿

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　　論文關(guān)鍵詞青霉素結(jié)合蛋白，放射性，經(jīng)氨葦青霉素多頭泡噬厲，Mecillinam

　　論文摘要 本文報道用放射性對經(jīng)氨節(jié)青霉素進行標記后用于青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的研究。結(jié)果表明，一經(jīng)氨節(jié)青霉素能較好地與細菌內(nèi)膜上所有的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合。進行競爭性結(jié)合實驗，頭抱嘎肪的主要靶位是PBP3，Mecnhnam的主要靶位是PBP:。我們建立的青霉素結(jié)合蛋白的測定方法，關(guān)鍵性的價廉易得，具有簡便、快速、等優(yōu)點，是一個值得繼續(xù)開發(fā)和研究的新途徑。

　　青霉素結(jié)合蛋白是存在于細菌被膜上一群能同青霉素和其它盡內(nèi)酞胺類抗生素贅合的細菌蛋白，從分子水平上對青霉素結(jié)合蛋白的研究，對于探討刀一內(nèi)酞胺類抗生素的作用機制和闡明某些細菌的耐機制具有重要的意義，國內(nèi)外已進行了多方面的研究（1-5）。我們從大腸桿菌K:，中提取細菌膜蛋白，利用放射性’腸碘建立了細菌青霉素結(jié)合蛋自的檢測方法，現(xiàn)報告如下。

　　實驗材料

　　一、抗生素:

　　經(jīng)氨節(jié)青霉素(Amox了eillin)，頭抱唾肪(Cefotaxime)和Meeillinam均為市售產(chǎn)品。

　　二、菌株:

　　大腸桿菌K12、:為北京生物制品檢定所提供。

　　三、培養(yǎng)基:

　　采用抗Ⅲ號培養(yǎng)基。

　　四、放射源:

　　一Nal由北京原子能所提供。

　　實驗方法

　　一、一裊氛節(jié)青霉素的制備:

采用氯胺一T法，在參考Masson等（6）的基礎(chǔ)上加以改進。、氫氨節(jié)青霉素20拌g和氯胺一混合，在室溫條件下反應(yīng)60~90秒后加入偏重亞硫酸鈉和碘化鉀完成整個反應(yīng)，將標記品稀釋至反應(yīng)所需濃度后放入O~4℃存放。

　　二、結(jié)合反應(yīng):

　　細菌培養(yǎng)及膜的制備參照Spratt等（7）的方法制得。在反應(yīng)管中加入提取的膜蛋自一經(jīng)氨節(jié)青霉素，30℃溫育10分鐘，加入青霉素Go.6mg，20%的+二烷基肌氨酸10川，室溫下放置20分鐘，離心100，。009x4。分鐘，將上清液、樣品緩沖液和琉基乙醇按6:3:1的比例混合，沸水浴3分鐘，冷卻后經(jīng)SDS一PAGE分離。

標記品和其它待測抗生素與膜蛋白的競爭性結(jié)合反應(yīng)參照Curltis等c7，的方法進行。待測抗生素頭抱唾肪與Micillinam分別與膜蛋自在30℃反應(yīng)10分鐘后加入一經(jīng)氨節(jié)青霉素，以后的過程與上述一致。

　　三、凝膠處理和放射自顯影:

　　將電泳后的凝膠立即進行固定、染色和脫色處理，用凝膠干燥器進行真空干燥。干燥后的凝膠與x光片緊密接觸后在一70℃條件下曝光5-7天。

　　實驗結(jié)果

　　一、標記品的鑒定:

　　我們對標記品用薄層層析法進行分析，如Fig.1所示。結(jié)果顯示: 氫氨節(jié)青霉素與非標記經(jīng)氨節(jié)青霉素的移動位置一致，游離的不超過10%。經(jīng)以后的結(jié)合實驗證實，在此標記條件下盡內(nèi)酞胺環(huán)是穩(wěn)定的。

　　二、結(jié)合實驗:

　　用Sarkosyl一可溶部分(內(nèi)膜)、Sarkosyl一不溶部分(外膜)和整個細胞外被電泳后進行放射自顯影觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)氨節(jié)青霉素與內(nèi)膜和整個細胞外被的青霉素結(jié)合蛋白的結(jié)合情況一致，其放射自顯影帶的位置符合報道的青霉素結(jié)合蛋白的分子量(用標準分子量蛋白做對照)，如Fig.2。標記品與外膜反應(yīng)后未出現(xiàn)任何自顯影帶，說明細菌外膜無青霉素結(jié)合蛋白存在。

　　用頭抱唾肘和Mieillinam分別與一經(jīng)氨節(jié)青霉素、細菌內(nèi)膜蛋白進行競爭性結(jié)合實驗，結(jié)果見Fig.3。從中可見，頭抱噴厲的特異靶位是PBP:，而Micillinam的特異靶位是PBP3，與文獻報道的結(jié)果相符（8）。

[1]

放射性碘標記羥氨芐青霉素用于青霉素結(jié)合蛋白的研究

　　討論

　　由于青霉素G與所有青霉素結(jié)合蛋白都具有良好的結(jié)合，所以，目前大家都采用其標記物作為研究工具。，4C一PenieillinG(PCG)是目前應(yīng)用最為廣泛的標記品，但此標記品的比放低(1.45~2.22火10一SBq/mol)，這就造成了標記品用量大且曝光時間太長，既使在使用熒光閃爍法(Flurograp-hy)、預(yù)曝光(Prefog義ing)和超低溫(一700C)條件下曝光等這些快速自顯影方法，仍需要20一，60天（9-11）。采用氛標記法提高比放，由于莊內(nèi)酞胺環(huán)的不穩(wěn)定性，幅射　　自分解快，所以不能作為商品出售。現(xiàn)在必須進口，價格昂貴。

　　用標記多膚類激素和蛋白質(zhì)已有大量的資料報道，但用于標記冬內(nèi)酞胺類抗生素的卻很少。由于許多壓內(nèi)酞胺類抗生素具有類似酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)成分對位經(jīng)基使苯環(huán)上的氫原子活躍易被取代(如經(jīng)氨節(jié)青霉素)，使放射性碘標記能夠進行。而青霉素G苯環(huán)的結(jié)構(gòu)特性則不適用于放射性碘標記。

　　我們制備的一經(jīng)氨節(jié)青霉素，由于其比放射性高(約Bq/mol)，即使不使用熒光閃爍法和預(yù)曝光，自顯影亦縮至1周左右，大大加快了整個實驗周期。整個標記過程簡便易行，重復(fù)性好，標記完后不需要特殊分離手段(電泳過程中自動分離)。更為重要的是解決了標記品的供給，為整個實驗節(jié)約大量經(jīng)費，并為其研究在國內(nèi)提供了一個新的技術(shù)方法。

參考文獻

（1）Spratt BG et ale Eur J Biochem 1977. 72; 341-352

（2〕Hedge PJ et al, Nature 1985, 318: 478-480

（3）Tuomanen E et aI: Antimicrob Agents Chemother 1986; 30: 659-661

（4〕Waxman DJ et al: Annu Rev Biochem 1983：52：825-829

（5〕雷雨等:《中國抗生素雜志》1388;13(5):321-325

（6〕Masson JM et al： Anal Biochem1983 128: 164-168

（7）Curbs NA et aI; Antimicrob Agents Chemother 1979, 16, 533-539

〔8〕Georgopapadakou APents Chemother NH et al, Antimicrob1980. 18. 834-836

（9）雷幼導(dǎo):放射自顯影的進展(待發(fā)表)

（10）Bonner WM et al; Eur J Biochem 1974: 46: 83-88

（11）Laskey RA. et ale Eur J Biochem 1975: 56: 335-341