- 相關(guān)推薦
壁虎醇提物對(duì)小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的抑制作用
【摘要】 目的觀察壁虎醇提物對(duì)小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的作用并探討機(jī)制。方法建立免疫功能正常小鼠腎囊膜下移植S180肉瘤模型，將40只雄鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照生理鹽水組、陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組(0.1 g·kg-1)、壁虎醇提物高劑量組(2.4 g·kg-1)、壁虎醇提物低劑量組(1.2 g·kg-1)共4組。腹腔注射給藥6 d后,殺鼠稱量荷瘤小鼠體重，評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠毒性;測(cè)量小鼠肉瘤體積，稱取移植瘤小鼠胸腺重、脾臟重，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù);用SABC免疫組化法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。結(jié)果壁虎醇提物可抑制小鼠肉瘤S180生長(zhǎng),環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高劑量組、壁虎醇提物低劑量組抑瘤率分別為74.5%，77.5%，57.5%，且各組末體重/初體重分別為0.94，1.03，0.99;壁虎醇提物對(duì)免疫器官無影響，而環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與陰性對(duì)照組比則有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);免疫組化顯示環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組與生理鹽水組比較VEGF蛋白的表達(dá)明顯減少。結(jié)論壁虎醇提物有抗腫瘤活性,其抗腫瘤的部分作用可能通過抑制腫瘤血管的生成而實(shí)現(xiàn) 。
【關(guān)鍵詞】 壁虎醇提物; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 腎包膜; S180肉瘤
壁虎又稱為守宮、天龍等，為壁虎科動(dòng)物無蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther或其他幾種壁虎除去內(nèi)臟的全體，是傳統(tǒng)的咸寒軟堅(jiān)中藥，具有祛風(fēng)、定驚、散結(jié)、解毒的功效。大量研究報(bào)道壁虎有顯著的抗腫瘤作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)中藥壁虎對(duì)食管癌細(xì)胞和S180荷瘤小鼠具有確切的抑制作用[1～3]。但壁虎成分十分復(fù)雜，究竟是何種成分發(fā)揮抗腫瘤作用，目前還不清楚，本課題組從干壁虎中提取得到壁虎醇提物，發(fā)現(xiàn)該醇提物可以抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤生長(zhǎng)。
1 材料與儀器
1.1 壁虎醇提物的制備及試劑加工過程：干無蹼壁虎1 000 g粉碎為粗粉，置于4 000 ml Tris-HCl緩沖液中(pH=7.4)，浸泡過夜，超聲細(xì)胞破碎，11 000 r·min-1離心，取上清，加無水乙醇至終濃度為55%，放4℃冰箱中，每20~30 min攪拌1次，4 h后11 000 r·min-1離心，取上清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，最終冷凍干燥。環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司)。含15%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液。VEGF免疫組化染色試劑盒(福州邁新生物科技開發(fā)有限公司)。
1.2 動(dòng)物及瘤株試驗(yàn)所用昆明種小鼠由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證:0001350 )，體質(zhì)量(26±3) g,均為雄鼠。S180腹水小鼠由河南省醫(yī)科所提供。
1.3 儀器游標(biāo)卡尺(廣西桂林量具刃具廠);高速冷凍離心機(jī)(江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠);萬分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);冷凍干燥儀(德國(guó)MARTIN CHRIST公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)。
2 方法
2.1 腎包膜下移植S180肉瘤模型建立將S180腹水小鼠抽出腹腔積液離心洗2 次,用無菌生理鹽水液稀釋成1 ×107 個(gè)/ ml的肉瘤細(xì)胞懸液。在小鼠右前腋下接種0. 2 ml肉瘤細(xì)胞懸液。7 d后，殺鼠取瘤。將腋下接種的S180肉瘤標(biāo)本, 于超凈工作臺(tái)剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 大小之瘤塊, 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中,冰浴存放備用。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉，按0.2 ml/100 g動(dòng)物體重麻醉小鼠。小鼠取俯臥位,常規(guī)消毒后從右側(cè)腎臟部位平行脊椎切開一約1 cm 的切口,托出腎臟。以眼科鑷輕提腎囊膜,以自制接種器將S180肉瘤組織小塊接種于腎囊膜下。還納腎臟于體內(nèi),分層縫合肌層及皮膚層。
2.2 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用觀察將40只動(dòng)物隨機(jī)分成4組，生理鹽水對(duì)照組、CTX組、壁虎醇提物高(2. 4 g/kg)、低(1.2 g/kg) 劑量組共4組,每組各10只,根據(jù)體重按0.1 ml/10 g自術(shù)后開始腹腔注射，CTX組第1天注射1次，其余組均1 d/次，給藥6 d后,稱鼠重，處死小鼠,打開腹腔, 以游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑(a)與寬徑(b), 計(jì)算瘤體大小(TS)，瘤塊生長(zhǎng)的△TS值和抑制率：TS= ab2/ 2 △TS= 末體積 - 初體積抑制率( %) = (1- 用藥組瘤體變化/ 對(duì)照組瘤體變化) ×100%
2.3 藥物毒性觀察以小鼠被處死前的體重(FBW) 與給藥前的體重(IBW) 之比值作為判定藥物對(duì)荷瘤小鼠毒性的指標(biāo)。FBW/IBW≥0.80, 則認(rèn)為所測(cè)藥物毒性較小。
2.4 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響 按上述方法給藥6 d后，處死動(dòng)物取胸腺，脾臟稱重。胸腺指數(shù)=胸腺重/體質(zhì)量，脾臟指數(shù)=脾臟重/體質(zhì)量。
2.5 小鼠S180肉瘤組織病理學(xué)變化腫瘤組織用10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色,光鏡觀察肉瘤組織病理變化。
2.6 VEGF蛋白表達(dá)的檢測(cè)用SABC免疫組化法,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。VEGF判定與分析：凡細(xì)胞漿、細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒或均質(zhì)樣棕黃色結(jié)構(gòu)者為VEGF免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：根據(jù)著色細(xì)胞的比例(染色范圍)及染色強(qiáng)度，染色范圍(陽性細(xì)胞比率)分為0～4級(jí)，陰性為0分;陽性細(xì)胞1%～25%為1分;25%～50%為2分;51%～75%為3分;76%～100%為4分。染色強(qiáng)度劃分為0～3級(jí),陰性為0分;弱陽性為1分;中等強(qiáng)度為2分;強(qiáng)陽性為3分;兩者得分相加為最后得分。
2.7 統(tǒng)計(jì)方法運(yùn)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單測(cè)t檢驗(yàn)。
3 結(jié)果
3.1 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用及毒性反應(yīng)環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高、低組抑瘤率分別為74.5%，77.5%，57.5%，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且毒性反應(yīng)小。結(jié)果見表1表1 各組對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用
3.2 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響 CTX組與對(duì)照組相比，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.05),壁虎醇提物各劑量組與對(duì)照組相比無明顯差異，結(jié)果見表2表2 各組對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響 3.3 移植瘤組織病理學(xué)變化經(jīng)HE染色后先在低倍鏡下觀察，然后在高倍鏡下(400×)觀察,陰性對(duì)照組癌細(xì)胞大小和形態(tài)不一致,細(xì)胞染色較深,癌細(xì)胞核體積增大,細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例增大，核的大小、形狀、染色不一，核染色深。核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，分布不均勻，核仁大，數(shù)目增多，核分裂相增多，可見不對(duì)稱性、多極性及頓挫性等病理性核分裂相，且癌組織間微血管豐富;環(huán)磷酰胺組有大片的細(xì)胞壞死區(qū)，壁虎各組均可見不同程度的片狀壞死區(qū)，瘤組織內(nèi)及其周圍微血管均減少。
3.4 壁虎對(duì)小鼠移植S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示VEGF蛋白在S180肉瘤組織中呈高表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿和包膜，環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組對(duì)VEGF的表達(dá)有明顯的抑制。結(jié)果見表3及圖1表3 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)
4 討論
從中藥中篩選有效的抗腫瘤藥物已成為國(guó)際上發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的重要途徑，不僅經(jīng)濟(jì)，療效可靠，還可以為設(shè)計(jì)更為理想的新藥提供新的化學(xué)結(jié)構(gòu)，成為創(chuàng)制新藥的先導(dǎo)化合物。壁虎是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有攻毒療瘡、散結(jié)止疼、活血化淤的功效，目前尚未被《中國(guó)藥典》收入，壁虎在臨床被廣泛地用于治療多種疾病，對(duì)腫瘤特別是食管癌，胃癌，肝癌等實(shí)體瘤具有獨(dú)特的療效[4，5]。本實(shí)驗(yàn)組提取的壁虎醇提物能顯著的抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的生長(zhǎng)，壁虎醇提物高、低劑量組抑瘤率可達(dá)到77.5% ，57.5%。研究同時(shí)本研究又對(duì)壁虎高、低劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示無明顯差異，而CTX組與對(duì)照組比較下降明顯。并且由FBW/IBW 結(jié)果顯示壁虎醇提物的毒性小。為探討壁虎醇提物抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，我們進(jìn)一步研究其對(duì)血管生成的影響。腫瘤組織內(nèi)血管形成是受機(jī)體內(nèi)促血管生成細(xì)胞因子和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果，VEGF是體內(nèi)促進(jìn)血管生成的主要的細(xì)胞因子[6]。在腫瘤的血管生成過程中，VEGF不僅促進(jìn)已經(jīng)存在的血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和存活，而且還動(dòng)員骨髓內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放入外周血，抑制VEGF可以降低腫瘤內(nèi)微血管的生成[7，8]。本實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了VEGF蛋白表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果表明與陰性對(duì)照組比，環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組VEGF蛋白表達(dá)均降低�？梢姳诨⒋继嵛锟鼓[瘤機(jī)制并不是通過增加機(jī)體的免疫力起作用，其機(jī)制可能與降低了VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。
圖1 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)(400×)
目前對(duì)無蹼壁虎抗腫瘤的活性成分研究較少。研究表明壁虎含有組織胺類、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素，含維生素C、維生素D、脂肪、粗纖維、胡蘿卜素等[9]。無蹼壁虎抗腫瘤活性成分含有多種物質(zhì)，但其抗腫瘤的有效成分究竟是何物，有待結(jié)合藥物化學(xué)進(jìn)行深入研究, 此外是否存在更多的作用靶點(diǎn)也有待于進(jìn)一步深入研究。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Fei Liu， Jian-Gang Wang，Shu-Ying Wang，et al.Antitumor effect and mechanism of Gecko on human esophageal carcinoma cell lines in vitro and xenografted sarcoma 180 in Kunming mice[J]. World J Gastroenterol 2008，14(25)： 3990.
[2] 劉 菲，王建剛，席守民，等.中藥壁虎抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(4)：957.
[3] 劉 菲，王淑英，李 艷，等.干壁虎對(duì)食管癌細(xì)胞和S180荷瘤小鼠的抑制作用[J].中藥材，2008，31(9)：1304.
[4] 崔永玲.金龍膠囊結(jié)合中藥辨證治療食管癌60例療效觀察[J].北京中醫(yī)，2006，25：381.
[5] 梁鐵軍，秦成勇，張才擎，等.金龍膠囊聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞治療原發(fā)性肝癌療效觀察[J].中國(guó)腫瘤臨床，2005，32(11)：641.
[6] Eichhorn ME，Kleespies A，Angele MK，et a1.Anogenesis in caneer：molecular mechanisms clinical impact [J].Langenbecks ArchSurg，2007，392：371.
[7] Daniel J Hicklin，Lee M Ellis.Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tmnor growth and angiogenesis[J].J Clin OncoI.2005，23(5)：1011.
[8] R Longo，G Gasparini.Challenges for patient selection with VEGF inhibitom[J].Cancer Chem Pharm，2007，60：151.
[9] 陳 明，黃堅(jiān)航.中藥壁虎現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)——中藥現(xiàn)代化，2001，3：53.
【壁虎醇提物對(duì)小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的抑制作用】相關(guān)文章：
環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠S180肉瘤抑瘤作用的量效關(guān)系03-19
正交試驗(yàn)法優(yōu)選金芍膠囊的醇提工藝03-26
人血管瘤裸小鼠移植模型形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察03-08
蘆薈對(duì)小鼠惡性腹水模型的影響12-04
小鼠心肌組織裂解上清液誘導(dǎo)小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞凋亡03-20
中藥對(duì)鎳暴露氧化損傷抑制作用11-20
對(duì)辯訴交易制度移植的探討03-25