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動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程監(jiān)測(cè)與控制
在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，隨著細(xì)胞的增殖、底物的消耗及產(chǎn)物的生成，整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)的狀態(tài)一直在產(chǎn)生變化。而各種狀態(tài)變量都有其限制范圍，當(dāng)超出其界限值時(shí)就會(huì)對(duì)培養(yǎng)過程產(chǎn)生消極的影響，降低培養(yǎng)效率。例如培養(yǎng)基的PH值在培養(yǎng)全過程都應(yīng)控制在6.8-7.4的范圍內(nèi)。因此在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)工藝中，利用過程監(jiān)測(cè)與控制技術(shù)使培養(yǎng)系統(tǒng)保持在最佳的狀態(tài)也是整個(gè)工藝中重要的一環(huán)。過程監(jiān)測(cè)是指應(yīng)用各種檢測(cè)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)過程中狀態(tài)變量的變化進(jìn)行追蹤的行為。當(dāng)這些變量與預(yù)測(cè)值或與預(yù)期變化方式相偏離時(shí)，通過過程監(jiān)測(cè)的手段便可以及早發(fā)現(xiàn)并開始利用已設(shè)定的模型計(jì)算如何改變培養(yǎng)狀態(tài)以及時(shí)補(bǔ)償這種偏離。而過程控制則利用過程監(jiān)測(cè)所提供的信息按照暨定方案進(jìn)行調(diào)整，以使培養(yǎng)過程向更好的方向發(fā)展。由于生物培養(yǎng)過程中許多關(guān)鍵變量的值不能夠直接在線測(cè)得，因此過程監(jiān)測(cè)的基本任務(wù)之一就是利用直接測(cè)得的變量值去估算間接變量的值，而這也就是狀態(tài)估計(jì)的概念。1、在線測(cè)量大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中由于大量細(xì)胞的代謝，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要。離線取樣測(cè)定特別是產(chǎn)物濃度測(cè)定往往需要一天的時(shí)間，因此這種測(cè)定結(jié)果，不能用來及時(shí)指導(dǎo)生物反應(yīng)器有關(guān)參數(shù)的控制和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費(fèi)用。因此在線測(cè)定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物濃度等大量數(shù)據(jù)，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析處理，及時(shí)對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行反饋控制是成功進(jìn)行大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需要[[i]]。在培養(yǎng)過程中對(duì)于過程監(jiān)測(cè)與控制具有重要意義同時(shí)又可在線測(cè)量的參數(shù)主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補(bǔ)料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業(yè)上應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，這些參數(shù)都是被在線測(cè)量的對(duì)象。溫度與PH值這兩個(gè)參數(shù)對(duì)于細(xì)胞而言是最基本的影響因素，而在控制時(shí)往往與其它參數(shù)相獨(dú)立。溫度的測(cè)量通常在生物反應(yīng)器內(nèi)部的單一位置，采用熱敏電阻檢測(cè)器（如Pt100熱電阻）進(jìn)行。PH值則多用復(fù)合式玻璃電極測(cè)量。Clark復(fù)膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測(cè)元件。所有此類檢測(cè)元件都已成為生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)配置。攪拌轉(zhuǎn)速的檢測(cè)一般是通過應(yīng)用磁感應(yīng)式，光感應(yīng)式或測(cè)速發(fā)電機(jī)來實(shí)現(xiàn)的。磁感應(yīng)式和光感應(yīng)式檢測(cè)器是通過計(jì)測(cè)脈沖數(shù)來測(cè)量轉(zhuǎn)速的。安裝在攪拌軸或電機(jī)軸上的切片切割磁場(chǎng)或光束而產(chǎn)生脈沖電訊號(hào)，則脈沖頻率就反映了攪拌轉(zhuǎn)速的大小。而測(cè)速發(fā)電機(jī)是安裝在攪拌軸或電機(jī)軸上的小型發(fā)電機(jī)，它的輸出電壓和轉(zhuǎn)速間有良好的線性關(guān)系。補(bǔ)料速率直接影響到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時(shí)間來計(jì)算，而泵的單位流量需在培養(yǎng)開始前用補(bǔ)料管道進(jìn)行實(shí)際校準(zhǔn)。如果不斷對(duì)補(bǔ)料瓶?jī)?nèi)的剩余體積進(jìn)行監(jiān)測(cè)，則可以得到足夠精確的補(bǔ)料數(shù)據(jù)來計(jì)算其他參數(shù)。對(duì)于通氣流量測(cè)定有多種不同的方法。根據(jù)作用原理，流量計(jì)可分成兩大類型：體積流量型和質(zhì)量流量型。體積流量型是根據(jù)流體動(dòng)能的轉(zhuǎn)換以及流體流動(dòng)類型的改變而設(shè)計(jì)的測(cè)量裝置。它會(huì)引起流體能量的不同程度的損失，而且測(cè)量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計(jì)和轉(zhuǎn)子流量計(jì)。質(zhì)量流量型是根據(jù)流體的固有性質(zhì)，如質(zhì)量、導(dǎo)電性、電磁感應(yīng)性、離子化、熱傳導(dǎo)性能等進(jìn)行設(shè)計(jì)的流量計(jì)。如利用熱傳導(dǎo)性能對(duì)空氣進(jìn)行測(cè)量時(shí)沒有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對(duì)尾氣中O2與CO2濃度的測(cè)量上可以利用質(zhì)譜儀進(jìn)行，但實(shí)際生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進(jìn)行測(cè)定。2、狀態(tài)估計(jì)過程變量估計(jì)問題大致可以分為兩類：狀態(tài)估計(jì)和參數(shù)估計(jì)，所謂狀態(tài)變量即是指表示系統(tǒng)動(dòng)態(tài)過程的性態(tài)所需的一組最少數(shù)目的變量，它是描述過程內(nèi)在本質(zhì)的，不一定是物理上可測(cè)的變量；而參數(shù)一般即指數(shù)學(xué)模型方程中待定的未知系數(shù)。狀態(tài)和參數(shù)的基本區(qū)別在于前者隨時(shí)間變化，而后者隨時(shí)間保持不變或緩慢變化。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)進(jìn)行分析時(shí)，最直接的方法就是通過在線測(cè)量獲得數(shù)據(jù)，再將其代入已有的過程模型中，從而得到關(guān)鍵狀態(tài)變量（如細(xì)胞密度、代謝速率、產(chǎn)物濃度等）的估計(jì)值。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，對(duì)環(huán)境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態(tài)估計(jì)所用的模型參數(shù)也處于不斷變化之中。故而狀態(tài)估計(jì)的問題就在于如何從一個(gè)運(yùn)行中的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)不斷獲得必需狀態(tài)參數(shù)的修正值，從而利用在線測(cè)得的直接數(shù)據(jù)正確地分析培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)。用于狀態(tài)估計(jì)的技術(shù)按照其性質(zhì)及在實(shí)踐中的應(yīng)用可分為許多類型。例如對(duì)系統(tǒng)本身及檢測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)產(chǎn)生的隨機(jī)干擾噪聲采用的濾波技術(shù)，及針對(duì)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)特性發(fā)展出的“推廣卡爾曼濾波”技術(shù)；應(yīng)用非線性動(dòng)態(tài)系統(tǒng)模型以直接檢測(cè)數(shù)據(jù)推算不能夠直接檢測(cè)變量的技術(shù)；應(yīng)用狀態(tài)觀測(cè)器以動(dòng)力學(xué)模型推測(cè)不能夠直接檢測(cè)變量的技術(shù)；應(yīng)用連續(xù)參數(shù)估算器不斷調(diào)整過程模型中的參數(shù)以適應(yīng)實(shí)際觀測(cè)數(shù)據(jù)，從而對(duì)狀態(tài)作出估計(jì)的技術(shù)等。3、過程控制的基本類型控制系統(tǒng)在對(duì)培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整時(shí)可以采用許多模式�？傮w上可分為開環(huán)（open-loop）控制系統(tǒng)與閉環(huán)（close-loop）控制系統(tǒng)。（1）開環(huán)控制系統(tǒng)若系統(tǒng)的控制器與被控對(duì)象之間只有順向作用，沒有反向作用，即系統(tǒng)的輸出量對(duì)控制作用沒有影響，則稱該系統(tǒng)為開環(huán)控制系統(tǒng)。以細(xì)胞培養(yǎng)過程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規(guī)參數(shù)（溫度、攪拌、DO、pH等）穩(wěn)定的同時(shí)，通過已建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)某一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養(yǎng)基補(bǔ)加策略及成分調(diào)整的依據(jù)，在細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變之前作出調(diào)整。在這方面，關(guān)于雜交瘤生長(zhǎng)和單抗生成的多種數(shù)學(xué)模型已經(jīng)建立[[ii],[iii]]。系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化的補(bǔ)料策略也有了相當(dāng)?shù)陌l(fā)展[[iv],[v]]。但由于這種模式要求對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的每一個(gè)細(xì)節(jié)都很清楚，在目前對(duì)生物體復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)理認(rèn)識(shí)不足的情況下，理論預(yù)測(cè)與培養(yǎng)實(shí)踐仍有很大差距，這使得理論模型應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)受到了很大限制。（2）閉環(huán)控制系統(tǒng)系統(tǒng)的輸出量或狀態(tài)變量對(duì)控制作用有直接影響的系統(tǒng)稱為閉環(huán)控制系統(tǒng)。閉環(huán)模式相對(duì)于開環(huán)模式主要的區(qū)別是不需要建立模型去預(yù)測(cè)細(xì)胞和微環(huán)境將來的變化,而是通過在線(on-line)和/或離線(off-line)檢測(cè)手段獲得狀態(tài)數(shù)據(jù)，由人工或控制軟件根據(jù)當(dāng)前值的變化即時(shí)調(diào)整培養(yǎng)設(shè)定參數(shù)，使培養(yǎng)系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)。這種模式是在細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變之后作出調(diào)整，也稱為反饋控制模式。細(xì)胞培養(yǎng)過程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環(huán)模式進(jìn)行的。同時(shí)由于控制的目的是減小實(shí)測(cè)值與設(shè)定值間的差距，因此屬于負(fù)反饋控制。針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)前研究的方向有：利用攝氧速率（OUR）與底物消耗速率、副產(chǎn)物生成速率等參數(shù)綜合估算的結(jié)果來反饋調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物的流加及培養(yǎng)基的灌流[[vi],[vii],[viii],[ix],[x]]；利用葡萄糖、谷氨酰胺等物質(zhì)的消耗速率及預(yù)先設(shè)定的濃度變化點(diǎn)來反饋調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物流加速率[[xi]]；利用培養(yǎng)過程中各種相關(guān)物質(zhì)濃度間的比值設(shè)計(jì)出“軟探針”，并以此反饋控制培養(yǎng)過程[[xii]]。（3）PID(proportional integral derivative)控制模型在培養(yǎng)實(shí)踐中，一些狀態(tài)變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點(diǎn)上就可以滿足要求，則其控制采用“三點(diǎn)控制模式”即可。具體控制過程是首先以設(shè)定點(diǎn)為基準(zhǔn)設(shè)置上、下限，當(dāng)溫度高于/低于設(shè)定上限時(shí)啟動(dòng)/關(guān)閉冷卻系統(tǒng)，當(dāng)溫度低于/高于設(shè)定下限時(shí)啟動(dòng)/關(guān)閉加熱系統(tǒng)，如此使溫度保持恒定。但在對(duì)更多的狀態(tài)變量（如PH，補(bǔ)料速率）進(jìn)行閉環(huán)控制時(shí)采用這種簡(jiǎn)單的方法會(huì)導(dǎo)致狀態(tài)變量不斷地圍繞設(shè)定值波動(dòng)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)生不良影響。在利用閉環(huán)模式對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行控制時(shí)，為有效而穩(wěn)定地減小實(shí)測(cè)值與設(shè)定值間的偏差而免去人為的干預(yù)，自動(dòng)控制理論中一種狀態(tài)校正模式—PID(proportional integral derivative)控制模式便得到了廣泛的應(yīng)用。它的微分方程表達(dá)式為式中u(t)為輸出值或設(shè)定值，e(t)為輸入值或?qū)崪y(cè)值與設(shè)定值間的偏差，而式中的設(shè)計(jì)參數(shù)分別為比例增益KP、積分增益KI和微分增益KD。利用這種控制模式可以使系統(tǒng)在受干擾而發(fā)生波動(dòng)時(shí)盡快進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，使細(xì)胞所受影響減到最低。具體的控制過程如圖所示，狀態(tài)變量在PID模式控制下隨時(shí)間進(jìn)行而趨于穩(wěn)定：
| 設(shè)定值 |
[i]林福玉，陳紹烈，劉紅，等.大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對(duì)策.生物技術(shù)通報(bào)，1999，7(1):32-35[ii] Nielsen L.K.,et al.Avoiding rapid growth at high cell densities:a potentially important optimisation criterion for hybridoma cultures.Cytotechnology,1992,9:21-34.[iii]胡顯文，李佐虎，陳建新，等.氣液雙升式反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及批式生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型.生物技術(shù)通訊，1999,10(2):104-108.[iv] C.S. Sanderson,et al.A structured, dynamic model for animal cell culture systems. Biochemical Engineering Journal,1999,3:203-211.[v] Christoph Herwig,et al.On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions.Biotech
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