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對(duì)蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)研究
摘要：目的認(rèn)識(shí)蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用活性的影響及蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的熒光性質(zhì)。方法用酶活性法觀察蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性的影響；用紫外光譜和熒光光譜研究蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的光譜性質(zhì)。結(jié)果蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性可產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制劑常數(shù)K1=6.13×10-5 mol/L；蘇木素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)為靜態(tài)猝滅；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。結(jié)論蘇木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，使胰蛋白酶分子構(gòu)象發(fā)生變化。
關(guān)鍵詞： 蘇木素 胰蛋白酶 熒光光譜 紫外光譜 酶活性
中藥蘇木的主要成分蘇木素(Haematorylin)是組織、病理實(shí)驗(yàn)室中最常用的染色劑，可用于細(xì)胞核染色［1］。蘇木素具有收縮血管、中樞抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消腫、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和動(dòng)物腸道中一種重要的蛋白水解酶，從該酶被發(fā)現(xiàn)以來，人們對(duì)其進(jìn)行了一定的研究，如用胰蛋白酶為催化劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的研究［3～5］。藥物對(duì)胰蛋白酶作用的性質(zhì)［6］及蘇木素與DNA作用的性質(zhì)的研究已引起重視［7］。本文主要通過紫外和熒光光譜法研究蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)，從而獲得蘇木素與胰蛋白酶作用時(shí)結(jié)構(gòu)變化、所處微環(huán)境等信息，探討蘇木素與胰蛋白酶相互作用的機(jī)制，并對(duì)蘇木素與胰蛋白酶作用活性的影響也進(jìn)行了研究。
1 器材
1.1 儀器熒光分光光度計(jì)，美國Cary Eclipse（瓦里安）產(chǎn)品；雙光束紫外可見分光光度計(jì)TU－1901，北京普析產(chǎn)品；pH－3C型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
1.2 藥品牛胰蛋白酶（生化試劑），上海海洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蘇木素（生物染色劑BS），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；硼酸（分析純 ），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。
2 方法
2.1 蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性影響在恒溫水浴箱中將酪蛋白、胰蛋白酶和蘇木素預(yù)熱，按酶活性的測(cè)定方法，在胰蛋白酶與酪蛋白的酶解反應(yīng)體系中加入不同體積的蘇木素溶液，測(cè)定蘇木素對(duì)酶活性的影響。胰蛋白酶活性及抑制常數(shù)測(cè)定參照文獻(xiàn)［8］方法操作。
2.2 蘇木素對(duì)胰蛋白酶紫外光譜的影響配制pH＝7.5的硼酸緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol/L CaCl2維持離子強(qiáng)度）；用硼酸緩沖溶液配制1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸餾水分別配制2.0×10-3mol/L和1.0×10-3mol/L的蘇木素溶液。
室溫條件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中準(zhǔn)確加入1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，掃描190～350 nm的吸收光譜。然后用微量注射往其中準(zhǔn)確加入1.0×10-3mol/L的蘇木素溶液10 μl，混勻，靜置2 min后掃描190～350 nm的吸收光譜。掃描1.0×10-3 mol/L蘇木素溶液190～350 nm的吸收光譜。
2.3 蘇木素對(duì)胰蛋白酶熒光光譜影響在1 cm×1 cm的石英比色皿中準(zhǔn)確加入 1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分別加入2.0×10-3mol/L的蘇木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混勻，放置5 min，分別在20，25，30，35℃下，測(cè)定其熒光光譜，激發(fā)波長為280 nm，繪制288～450 nm的熒光光譜。
2.4 蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的同步熒光將“2.3”項(xiàng)下所配的溫度為298 K的溶液，固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔△λ分別為20 nm和60 nm，同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射波長并記錄同步熒光光譜。
3 結(jié)果
3.1 蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性的影響蘇木素對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，當(dāng)蘇木素濃度為4.5×10-4 mol/L時(shí)，蘇木素使胰蛋白酶的相對(duì)活性下降到70.2%，抑制率為29.8%。在不同的底物濃度（40，30，20，10 g/L酪蛋白溶液）下，按酶活性的測(cè)定方法測(cè)定酶的反應(yīng)速度，其結(jié)果以1/v對(duì)抑制劑量用Dixon作圖法求出Ki=6.13×10-5mol/L，抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
3.2 蘇木素對(duì)胰蛋白酶紫外吸收光譜影響圖1為T＝298K，pH＝7.4時(shí)的吸收光譜。蛋白質(zhì)分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有紫外吸收，蛋白質(zhì)的吸收波長一般在280 nm附近。從圖1可以看出，當(dāng)往胰蛋白酶中加入蘇木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明顯增高，說明蘇木素與胰蛋白酶之間發(fā)生了作用，改變了胰蛋白酶的構(gòu)象,而這種作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基的π－π*電子躍遷。
3.3 熒光光譜以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很強(qiáng)的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長激發(fā)蘇木素溶液，在354 nm附近則沒有熒光峰，證明蘇木素不會(huì)產(chǎn)生與胰蛋白酶干擾的熒光。固定胰蛋白酶的量，隨著體系中蘇木素濃度的增加，胰蛋白酶的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，其最大發(fā)射波長未發(fā)生明顯的變化（見圖2）。
3.4 熒光猝滅常數(shù)及猝滅機(jī)理
3.4.1 蘇木素對(duì)胰蛋白酶的猝滅效應(yīng)一般情況下，可依據(jù)不同溫度下的結(jié)果區(qū)別是動(dòng)態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，隨著溫度升高，將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。而對(duì)于靜態(tài)猝滅則溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小。本文以相同的實(shí)驗(yàn)條件，分別測(cè)定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的熒光猝滅光譜，以［F0/F－1］對(duì)［C］作Stern－Volmer圖見圖3。從圖3可以看出蘇木素在溫度低于25℃時(shí)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低，即符合靜態(tài)猝滅機(jī)理。
當(dāng)猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，服從Lineweaver-Burk方程。20，25℃時(shí)以（F0－F）－1對(duì)［C］－1擬合Lineweaver-Burk方程，由圖4可見該雙倒數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，再次確定在20，25℃時(shí)為靜態(tài)猝滅。
3.4.2 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及結(jié)合常數(shù)KA的計(jì)算設(shè)蘇木素與胰蛋白酶形成n個(gè)結(jié)合點(diǎn)位的復(fù)合物則有：
Lg［（F0－F）/F］＝lgKA nlg［C］
分別作不同溫度下Lg［（F0－F）/F］－lg［C］的雙對(duì)數(shù)擬合，得到不同溫度下的KA和n見表1。表1 蘇木素與胰蛋白酶的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（略）
3.4.3 作用力類型的確定猝滅體與生物大分子之間的相互作用力
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