紫杉醇和吉西他濱對鼻咽癌HNE2細胞系 協同放射增敏的作用

【摘要】目的觀察紫杉醇、吉西他濱兩藥聯合對鼻咽癌細胞系HNE2的放射增敏作用，并探討其可能機制。方法將HNE2細胞分為單純照射組、吉西他濱（GE）＋照射組、紫杉醇（PA）＋照射組及GE PA 照射組，用克隆形成實驗計算兩藥物單用及合用的放射增敏比，流式細胞儀法分別檢測、比較各組的細胞凋亡率及細胞周期變化。Westernblot法測定各組細胞凋亡相關基因bcl?2、bax的表達水平。結果吉西他濱、紫杉醇及兩藥聯合使用的放射增敏比分別為1.06、1.13和1.34。流式細胞儀檢測顯示吉西他濱聯合射線主要誘導S期阻滯（96.03％），誘導凋亡率為31.62％；紫杉醇聯合射線引起的阻滯以G2＋M期為主（75.71%），誘導細胞凋亡率為44.56%；兩藥合用并聯合照射后G2＋M期比例（65.98%）有所下降，同時S期比例（33.33%）有所上升（與PA 放射組比較），細胞凋亡率達到73.28%。在四組中bcl?2的表達呈逐步下降趨勢，而bax的表達則呈逐步上升趨勢。結論吉西他濱、紫杉醇單用及兩藥聯合對鼻咽癌細胞系HNE2均有放射增敏作用，且兩者協同增敏作用顯著高于單獨增敏作用，顯示了兩藥聯合應用有助于提高鼻咽癌的放射敏感性。兩者協同放射增敏作用的機制可能與凋亡有關。

【關鍵詞】紫杉醇吉西他濱鼻咽癌放射增敏

0引言

放射治療一直是治療鼻咽癌的首選方法。近年來已有作者報道分別將紫杉醇[1]（Paclitaxel，PA）和吉西他濱[2]（Gemcitabine，GE）聯合放射治療鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但兩藥聯合使用增加放射敏感性的報道尚屬少見。本試驗選用鼻咽癌細胞株HNE2作為研究對象，研究了紫杉醇和(或)吉西他濱聯合放射對HNE2細胞增殖、凋亡的影響，以探討PA和GE協同作用對HNE2細胞的放射敏感性的影響及其可能機制。

1材料和方法

1.1細胞株、藥物和試劑人鼻咽癌HNE2細胞株購自湖南湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所。紫杉醇和吉西他濱分別為美國百時美施貴寶公司及禮來公司產品。兔抗人多克隆第一抗體及生物素標記的第二抗體由北京中山生物技術有限公司提供，系美國SantaCruz產品。噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2細胞及培養(yǎng)條件人鼻咽癌HNE2細胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，添加100IU/ml青霉素及鏈霉素，37℃、100%濕度、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3MTT法測定藥物IC50及IC10值HNE2細胞按103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待16～18h后貼壁生長至對數生長期時，將PA用培養(yǎng)基依次稀釋為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml，分別按100μl/孔加入96孔板，每一濃度設3復孔，并設正常對照孔及空白調零孔。同法將HNE2細胞按5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，GE依次稀釋為2000μg/ml、200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml加入96孔板。置37℃培養(yǎng)箱孵育24h后，棄去藥物及陳舊培養(yǎng)基，每孔加新鮮配制的MTT（5mg/ml）20μl再次孵育4h，棄去MTT液，每孔加DMSO150μl，振蕩15min，酶聯免疫檢測儀于490nm波長測定吸光度D。重復3遍。腫瘤細胞抑制率＝（1?實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%

1.4克隆形成實驗測定藥物放射增敏性將正常細胞、GE作用24h后細胞、PA作用24h后細胞及兩藥聯合作用（濃度同上）24h后細胞組常規(guī)消化后分別按不同照射劑量以不同密度接種于60mm培養(yǎng)皿，每組細胞給予6MVX射線單次照射0、2、4、6、8Gy，恒溫箱中培養(yǎng)12d。12d后取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，甲醇固定15min，去除固定液，姬姆薩染色30min，對含50個細胞以上的克隆進行計數。多靶單擊模型擬合細胞存活曲線并計算增敏比。 論文網在線

1.5流式細胞分析將培養(yǎng)于50ml培養(yǎng)瓶中呈對數生長的HNE2細胞隨機分為：（1）單純照射組、（2）GE＋放射組、（3）PA＋放射組、（4）兩藥聯合＋放射組。單純照射組僅給予6Gy照射，其余三組分別給予GE（0.2μg/ml）、PA（0.1μg/ml）及GE和PA的混合液作用24h后棄藥并照射6Gy。以上四組共同孵育24h，常規(guī)消化后800r/mim離心5min，棄上清，PBS清洗2遍，80%乙醇4℃固定過夜，離心去乙醇，PBS清洗2遍，用RNase（終濃度0.02mg/ml）、PI（終濃度0.1mg/ml）及0.3%的Triton?X100混合配制成的PI染液避光染色30min，流式細胞儀分析細胞周期及凋亡情況。

1.6WesternBlot法測定bcl?2、bax的表達分組及每組處理方法同1.5，將四組細胞常規(guī)消化后置EP管800r/min離心5min，棄上清，PBS清洗2遍，每管加新鮮配制的裂解液100μl，4℃裂解30min，隨后4℃12000r/min離心15min，吸上清，每個樣本均分裝成5μl及60μl兩管，－20℃保存。將5μl/管蛋白加上樣buffer沸水煮5min，BCA法測樣本蛋白濃度。用15%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本蛋白，電轉移至硝酸纖維素濾膜上，與兔抗人bcl－2及bax多克隆抗體4℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1h，ECL顯色，X射線片顯影。實驗重復3遍。

1.7統計學處理所用數據均以均數±標準差表示，結果用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1GE及PA的IC50和IC10值MTT實驗表明不同濃度梯度的PA及GE作用細胞24h后，細胞抑制率隨藥物濃度的增加而增加，結果見表1。應用IC50計算軟件求出GE的IC50及IC10分別為173.2μg/ml和0.210μg/ml。PA的IC50及IC10分別為2.73μg/ml和0.13μg/ml。以下的實驗均選用兩種藥物的大致IC10濃度0.2μg/ml（GE）和0.1μg/ml（PA）。表1GE及PA對HNE2細胞的生長抑制作用

2.2GE、PA及GE PA對細胞放射敏感性的影響將正常細胞、GE、PA作用后細胞及兩者聯合作用后細胞分別給予0、2、4、6、8Gy射線照射后多靶單擊模型擬所得結果如圖1。單純對照組細胞存活曲線的D0=3.17，Dq＝1.73；GE組的D0=2.99，Dq＝1.52；PA組的D0=2.8，Dq＝1.44；聯合用藥組的存活曲線與前三組相比明顯下移，肩峰變窄，D0=2.37，Dq＝1.07。吉西他濱的增敏比（單純照射組D0與吉西他濱組D0之比值，以下類推）為1.06，紫杉醇的增敏比為1.13，而兩藥聯合后的增敏比為1.34，明顯高于兩藥分別使用時的增敏比(P

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