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永生化胚胎肝細(xì)胞系的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
作者：李羽，白雪帆，王軍，徐哲，張巖【關(guān)鍵詞】 永生化；肝細(xì)胞；細(xì)胞系；生物學(xué)特性；SV40；脂質(zhì)體
Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line
【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its biological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes, and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.
【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterization; SV40; liposomes
【摘要】 目的: 構(gòu)建永生化肝細(xì)胞系并對其生物學(xué)特性及某些功能進(jìn)行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至體外分離培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞，使其永生化，進(jìn)一步鑒定其形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)功能. 結(jié)果： 經(jīng)G418 700～300 mg/L篩選，40 d后獲得一株陽性克隆. 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的大多數(shù)典型特征. 永生化胚胎肝細(xì)胞克隆形成率為31.2%，染色體核型分析表明細(xì)胞核型無明顯異常，軟瓊脂集落形成試驗表明細(xì)胞在軟瓊脂中不能生長，免疫組化證明SV40T基因已整合入細(xì)胞，而且該細(xì)胞具有合成白蛋白的功能. 結(jié)論： 新建胚胎肝細(xì)胞系具有與原代肝細(xì)胞類似的形態(tài)特征及生物學(xué)功能，可以成為生物人工肝及肝細(xì)胞移植研究中的理想細(xì)胞材料.
【關(guān)鍵詞】 永生化；肝細(xì)胞；細(xì)胞系；生物學(xué)特性；SV40；脂質(zhì)體
【中圖號】 R512.6
0引言
原位肝移植可以有效治療各種原因引起的肝功能衰竭，因而成為治療肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技術(shù)復(fù)雜、價格昂貴尤其是供肝短缺的困擾，使它的臨床應(yīng)用受到很大限制，難以及時有效地挽救患者的生命. 研究顯示生物人工肝及肝細(xì)胞移植可以作為一種有效的替代治療手段，幫助患者渡過危險期等待肝移植甚至直接取得令人滿意的療效，因而為肝衰竭的治療提供了一種新的選擇［1-5］. 而該項技術(shù)的應(yīng)用需要足夠數(shù)量肝細(xì)胞材料，動物肝細(xì)胞或者各種肝細(xì)胞系由于存在病毒感染及潛在的致瘤危險，無法成為理想的選擇. 從理論上講人源性肝細(xì)胞應(yīng)該是最佳材料，但原代細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖及傳代困難，而且來源同樣受到很大限制，為此我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，構(gòu)建了一株永生化胚胎肝細(xì)胞系，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，希望可以為生物人工肝及肝細(xì)胞移植的臨床開展提供理想而充足的細(xì)胞材料.
1材料和方法
1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的質(zhì)粒pcD2由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科腫瘤中心劉廣芝教授惠贈，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 14～28 wk水囊引產(chǎn)死胎由本院婦產(chǎn)科提供，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；DMSO及秋水仙素為Sigma公司產(chǎn)品；抗SV40T單克隆抗體購自USBio公司；人血白蛋白單克隆抗體購自DAKO公司，質(zhì)粒提
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