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大鼠延髓巨細胞網(wǎng)狀核與腦干內(nèi)臟 運動核間的纖維投射研究
【摘要】 目的 研究成年大鼠延髓巨細胞網(wǎng)狀核與腦干內(nèi)臟運動核的神經(jīng)聯(lián)系。方法 將順、逆行神經(jīng)示蹤劑WGA- HRP注入一側(cè)巨細胞網(wǎng)狀核，光學(xué)顯微鏡下觀察該核團與一般內(nèi)臟運動核（迷走神經(jīng)背核、上泌涎核、下泌涎核）和特殊內(nèi)臟運動核（面神經(jīng)核、 疑核、三叉神經(jīng)運動核）的纖維聯(lián)系。結(jié)果 在一般內(nèi)臟運動核、雙側(cè)迷走神經(jīng)背核、下泌涎核均可 看到少量逆行標記細胞及神經(jīng)纖維末梢，但上泌涎核未發(fā)現(xiàn)任何標記，在特殊內(nèi)臟運動核的面神經(jīng)核、疑核、三叉神經(jīng)運動 核團雙側(cè)均見逆行標記細胞及神經(jīng)纖維終支。 結(jié)論 巨細胞網(wǎng)狀核與大多數(shù)腦干內(nèi)臟運動核有雙向纖維聯(lián)系。
【關(guān)鍵詞】 巨細胞網(wǎng)狀核;神經(jīng)示蹤劑;迷走神經(jīng)背核;疑核;大鼠
經(jīng)典神經(jīng)解剖學(xué)清楚地闡述了位于腦干抑制區(qū)的巨細胞網(wǎng)狀核（gigantocellular reticular nucleus）通過網(wǎng)狀脊髓束的神經(jīng)支配對骨骼肌起抑制效應(yīng)［1-2］。根據(jù)諸多基礎(chǔ)及臨床研究，其對肢體協(xié)調(diào)運動的抑制性 調(diào)控作用已被醫(yī)學(xué)界公認。近年來隨著人們對功能認識相對空白的腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)這一區(qū)域的深入了解，不斷發(fā)現(xiàn)巨細胞網(wǎng)狀核的其他調(diào)控作用。比如其對心血管、呼吸等內(nèi)臟活動有不同程度的影響［3-5］，認為該核 團所在區(qū)域?qū)儆诮档脱獕旱摹敖祲簠^(qū)”及調(diào)節(jié)呼吸節(jié)律的吸氣中樞［6］。臨床痙攣性腦癱患者由于中樞抑制與興奮調(diào)節(jié)失衡，產(chǎn)生軀體運動及胃腸道功能障礙，這些都說明巨細胞網(wǎng)狀核與內(nèi)臟活動有著某些聯(lián)系，但目前國內(nèi)外研究內(nèi)臟運動核與巨細胞網(wǎng)狀核相關(guān)聯(lián)系的資料較少，本實驗主要觀察該核團與直接調(diào)控內(nèi)臟活 動的腦神經(jīng)核團間的神經(jīng)聯(lián)系，說明它與內(nèi)臟活動有關(guān)聯(lián)。
1 材料和方法
1.1 動物和試劑
180～220 g Wistar大鼠30只，雌雄不限。4%WGA-HRP（溶液）購自美國Sigma公司，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為美國Research公司產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO）為美國Merck公司產(chǎn)品，SNF、鎢酸鈉（ST）均為美國Sigma公司產(chǎn)品。
1.2 儀器
江灣Ⅰ型C腦立體定位儀，CM1800恒冷冰凍切片機，C09 - A4772型微量注射器，90型牙科鉆，P-30型 微玻管拉制儀，德國Leica光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影 裝置。
1.3 方法
大鼠在戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）或水合氯醛（500 mg · kg-1）腹腔注射全麻下，通過兩側(cè)耳桿和齒栓將大鼠頭部固定于腦立體定位儀，剪毛，消毒，在大鼠頭部 切一正中切口，分離皮下組織，充分暴露顱骨前囟到人字縫后1cm ，按照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜定位Gi（圖譜中巨細胞網(wǎng)狀核的縮寫），以顱骨中線左側(cè)或右側(cè)旁開1 mm與外耳道連線后方2.8 mm 交匯處為圓心（Gi中心點坐標）鉆一小孔，清除此孔內(nèi)腦膜及少量溢出的腦脊液，將前端套好微玻管（已吸入WGA-HRP）的1 μl微量注射器固定在定位儀推進桿上，按上述坐標使微玻管尖端從腦表面向下小心推進7.6 mm，緩慢注入4%WGA-HRP 0.05～0.10 μl，留針20 min，緩慢起針，縫合。有28只動物存活2～4 d （少數(shù)為4d ），在麻醉狀態(tài)下，經(jīng)左心室快速灌流20～25 ℃生理鹽水100 ml沖去血液，繼而灌入4 ℃體積分數(shù)為4%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1 mol ·L-1磷 酸緩沖液（PBS，pH7.4）固定，打開顱骨，迅速取出整個腦組織，后固定4 h，再入4℃ 20%蔗糖PBS液沉底，截取腦干部分，冰凍冠狀連續(xù)切片，厚40 μm，隔1取1，注射部位附近切片全取，切片收集于裝有0.01 mol·L-1PBS液的孵育盒，其中10只動物切片按Mesu- lam1978年推薦的TMB-SNF法［7］顯色，另外18只動物切片用TMB-ST法［8］ 顯色。整個顯色反應(yīng)過程注 意避光。
1.4 切片處理
將反應(yīng)后的切片順次貼在涂抹鉻釩明膠的載玻片上，避光晾干，切片收集2套，其中1套中性紅復(fù)染，用于對照觀察和定位核團。過梯度酒精、二甲苯，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄、拍片。
2 結(jié) 果
2.1 注射區(qū)
低倍鏡下檢查注射部位，其中以Gi中心為圓點向周圍擴散但未超出該核外圍的共23組，觀察這23組切片注射部位和相應(yīng)內(nèi)臟運動核。注射部位大致呈卵圓形，由內(nèi)向外分三層環(huán)繞中心，最內(nèi)層的中心有不同程度破潰壞死組織，周圍呈淺 藍色環(huán)形區(qū)帶;毗鄰層藍黑色，含較多顯色反應(yīng)顆粒，但細胞形態(tài)難以分辨;最外層顏色較淺，向周圍輻射，可見輪廓清晰的神經(jīng)細胞胞體及突起（圖1）。
2.2 標記細胞及纖維終末的分布
一般內(nèi)臟運動核:迷走神經(jīng)背核、下泌涎核雙側(cè)均可見逆行標記細胞和順行纖維終末，但上泌涎核沒有標記。迷走神經(jīng)背核標記細胞胞體大致呈鐮刀形、橢圓形，個體中小型，標記細胞數(shù)目較多，每張切片4～6個;下泌涎核多為小型梭形細胞，標記細胞數(shù)目較少，每張切片1～3個，兩核團順行標記纖維終末分布稀疏 （圖2～5）。特殊內(nèi)臟運動核:面神經(jīng)核、疑核、三叉神經(jīng)運動 核雙側(cè)均見逆行標記細胞和順行纖維終末。面神經(jīng)核標記細胞多為鐮刀形、扁長形，中等大小，標記細胞和纖維終末較多，每張切片7～10個;疑核大致為三角形，中等大小，每張1～3個切片;三叉神經(jīng)運動核呈叉形、鐮刀形胞體，個體較大，每張切片2～4個;后兩者纖維終末標記都不多（圖6～10）。
3 討 論
本實驗結(jié)果表明，巨細胞網(wǎng)狀核與這些直接調(diào)控內(nèi)臟活動的運動神經(jīng)核有相互作用，間接反映Gi對內(nèi)臟活動有影響。目前為止，科研和臨床病例觀察說明 該核團是神經(jīng)沖動傳遞的中繼站，在高級到低級中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起承上啟下的作用，本實驗也說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)對機體其他活動調(diào)控（除協(xié)調(diào)軀體運動）方面，Gi也參與其中，但具體作用模式還有待繼續(xù)探究。本實驗應(yīng)用兩種顯色方法，作者體會要獲得滿意的呈色結(jié)果，比如標記細胞顯色分明，非特異性沉淀少，TMB-ST法的控制條件更容易掌握且標記效果好。相比之下TMB-SNF法有如下不足:（1）需要的孵育液 等的配制較繁瑣;（2）要嚴格注意避光，否則標記物很 容易見光分解褪色;（3）需SNF做穩(wěn)定劑，切片標記物保持時間短。
【參考文獻】
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