對(duì)兩種凝血酶原提取方法的比較

摘要： 目的 比較等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法 分別采用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)鈣離子激活得到凝血酶，通過(guò)凝血酶效價(jià)測(cè)定、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，計(jì)算出凝血酶的比活性。結(jié)果 采用等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為11.01±1.54 U/mg，采用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為130.17±12.30 U/mg，經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)，P＜0.01.結(jié)論 與等電點(diǎn)沉淀法相比，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度更高。

關(guān)鍵詞： 凝血酶原； 凝血酶； 等電點(diǎn)沉淀法； 檸檬酸鋇吸附法

凝血酶是參與機(jī)體凝血過(guò)程的一個(gè)重要的凝血因子，在體內(nèi)以凝血酶原形式存在［1］。20世紀(jì)中期開始人們將凝血酶應(yīng)用于臨床，由于其療效顯著，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。之后美英日等國(guó)從牛血漿中分離出凝血酶應(yīng)用于臨床，并證明將動(dòng)物凝血酶應(yīng)用于人體未出現(xiàn)凝血酶抗原性，口服和局部外用時(shí)無(wú)過(guò)敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)等，因而目前所使用的凝血酶制劑大多來(lái)源于動(dòng)物血漿，國(guó)內(nèi)采用豬血漿制備凝血酶的報(bào)道較多［2］。等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)的鈣離子激活可得到凝血酶。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究比較應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異，哪種方法得到的凝血酶原純度更高？更適合用于提取凝血酶原?本文對(duì)這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的純度進(jìn)行了比較。為相關(guān)實(shí)驗(yàn)中選擇合適的凝血酶原提取方法提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。
1.2 主要試劑
纖維蛋白原和凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，Bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.
1.3 主要儀器
GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析儀。
1.4 方法
1.4.1 凝血酶原提取 將收集到的5份豬血漿按1～5編號(hào)，各均分為2份，其中1份采用等電點(diǎn)沉淀法提取凝血酶原，另1份采用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。
1.4.1.1 等電點(diǎn)沉淀法 豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5 %冰乙酸將其pH調(diào)至5.3，4℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，過(guò)濾備用。
1.4.1.2 檸檬酸鋇吸附法 豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30 min，靜置30 min后，3 000 r/min離心30 min，棄上清。沉淀用溶液B洗滌，3 000 r/min離心15 min，棄上清。重復(fù)洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3 000 r/min離心15 min取上清。上清液用溶液D于4℃透析過(guò)夜。3 000 r/min離心15 min取上清液，即為凝血酶原溶液。
1.4.2 凝血酶原激活 用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2 終濃度為0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，室溫靜置2 h，過(guò)濾即得凝血酶溶液。
1.4.3 凝血酶比活性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［4］提供的方法配制0.1 %纖維蛋白原溶液。
凝血酶效價(jià)測(cè)定［4,5］：取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水配制成效價(jià)(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取1×10 cm的塑料試管6支，各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴預(yù)熱5 min，再分別取已37℃預(yù)熱的上述6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μl，迅速加入上述各試管中，立即計(jì)時(shí)并搖勻，記錄凝固時(shí)間。每個(gè)濃度測(cè)2次，求平均值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品用生理鹽水稀釋適當(dāng)濃度，取50 μl，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法平行測(cè)定2次，求平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計(jì)算樣品的效價(jià)。
根據(jù)文獻(xiàn)［6］，采用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本平行測(cè)2次，取平均值。根據(jù)公式：酶比活性=酶效價(jià)/溶液蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算凝血酶溶液的比活性。
2 結(jié)果與分析
以凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液效價(jià) (U/mL)為X，對(duì)應(yīng)的凝固時(shí)間（sec）為Y進(jìn)行直線回歸處理，并求得直線回歸方程，所得方程式為：Y=62.913?5.994X，r≈0.994 8.將凝血酶樣品的凝固時(shí)間代入回歸方程，即可計(jì)算得出樣品的凝血酶效價(jià)(見表1、圖1)。
采用等電點(diǎn)沉淀法得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性為11.01±1.54 U/mg，而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性可達(dá)到130.17±12.30 U/mg。其比活性經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，其概率P=3.54×10?5＜0.01，說(shuō)明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異，后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質(zhì)濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進(jìn)一步純化，以提高酶的比活性。因而，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優(yōu)于等電點(diǎn)沉淀法，得到的凝血酶純度較高。
3 討論

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