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靈芝孢子能夠調(diào)節(jié)妊高征大鼠所生幼鼠 海馬線粒體相關(guān)分子物質(zhì)的
作者：程進(jìn)軍， 曾園山， 熊軼， 張偉， 陳穗君， 鐘志強(qiáng)【摘要】 探討靈芝孢子對(duì)妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關(guān)分子物質(zhì)的影響。方法:用一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）抑制劑N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）給予大鼠腹腔注射制備妊高征模型， 在此基礎(chǔ)上胃飼靈芝孢子。應(yīng)用cAMP放免法、RT-PCR、酶活力檢測(cè)等技術(shù)評(píng)價(jià)靈芝孢子對(duì)妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關(guān)分子物質(zhì)水平的影響。結(jié)果:妊高征孕鼠的剛分娩幼鼠海馬cAMP水平、線粒體DNA（mtDNA）水平及ATP合酶活力都降低。pgc1α表達(dá)水平與正常對(duì)照大鼠比較沒有變化。 生后30 d的幼鼠海馬cAMP水平、mtDNA水平、ATP合酶活力和pgc1α表達(dá)水平低于正常對(duì)照大鼠。胃飼靈芝孢子后，妊高征大鼠的剛分娩幼鼠和生后30 d的幼鼠海馬cAMP水平和mtDNA含量恢復(fù)到正常對(duì)照大鼠水平，ATP合酶活力和pgc1α表達(dá)水平也有恢復(fù)性增高。結(jié)論:靈芝孢子具有調(diào)節(jié)妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關(guān)分子物質(zhì)水平的作用。
【關(guān)鍵詞】 大鼠
靈芝孢子（ Ganoderma spore， GS）是經(jīng)過現(xiàn)代技術(shù)加工處理的靈芝生殖細(xì)胞，具有一定的防治疾病的功效。本研究組以往研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子可以促進(jìn)受損傷的神經(jīng)元存活及其軸突再生［1， 2］，這提示靈芝孢子具有神經(jīng)生物活性。一氧化氮（nitro-gen monoxide， NO）是調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)功能的重要信使分子。在妊娠高血壓征（妊高征）孕婦的血液中發(fā)現(xiàn)，NO和精氨酸的含量降低［3］。我們也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用一氧化氮合酶（nitric oxide syn-thase， NOS）抑制劑N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）抑制NO生成，可以造成孕鼠的血壓升高及其胎鼠和所生幼鼠海馬的損傷，喂服靈芝孢子后可以部分緩解NO水平降低引起的損害［4， 5］。最新研究提示，NO可以促進(jìn)線粒體生物發(fā)生（mitochondrial biogenesis）［6］。然而，妊高征孕鼠的NO水平降低是否引起其所生幼鼠海馬線粒體生物發(fā)生障礙，目前尚未見報(bào)道。本研究試圖探討靈芝孢子對(duì)妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關(guān)分子物質(zhì)水平的影響，為臨床服用靈芝孢子干預(yù)妊高征提供實(shí)驗(yàn)資料。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD成年雌性大鼠40只，體質(zhì)量200～230 g，11～12周齡;SD成年雄性大鼠10只，體質(zhì)量250～300 g，13～15周齡。由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為（醫(yī)動(dòng)字）第26-99C016號(hào)。按雌雄比例為2∶1合籠后的第2天觀察雌鼠陰道黏液（涂片法），有精子者被認(rèn)為是妊娠0天（E0）。將這些妊娠鼠隨機(jī)分為:（1）正常對(duì)照組，于妊娠14～20 d（E14～E20）腹腔注射生理鹽水 胃飼蒸餾水;（2） L -NAME 蒸餾水組，注射 L -NAME 胃飼蒸餾水;（3） L -NAME 精氨酸組，注射 L -NAME 胃飼 L -精氨酸100 mg/（kg·d），分2次胃飼;（4） L -NAME 靈芝孢子組，注射 L -NAME 胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），分2次胃飼;（5）靈芝孢子 L -NAME 靈芝孢子組，注射 L -NAME前 1周 胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），注射 L -NAME后胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），均分2次胃飼。每組 5只。 除正常對(duì)照組每天分兩次注射生理鹽水和胃飼蒸餾水外，各組妊娠鼠于E14～E20腹腔注射 L -NAME 60 mg/（kg·d），分2次注射，2次之間相隔10 h。每次注射后2 h，再接著胃飼相應(yīng)的蒸餾水、 L -精氨酸或靈芝孢子。
1.2 藥物 L -精氨酸購自美國Amresco公司， L -NAME 購自美國Sigma公司。靈芝孢子（2036）購自Holistal International Ltd，批號(hào)GANSP- SP04040104。 L -NAME用生理鹽水配制成溶液， L -精氨酸用蒸餾水配制成溶液，靈芝孢子用羧甲基纖維素鈉配制成溶液。
1.3 取材 從上述處理的每只孕鼠剛分娩的0 d（P0）幼鼠中隨機(jī)選擇3只，取其海馬組織，分別用放射免疫、RT-PCR以及酶活力測(cè)定等方法進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。剩余幼鼠飼養(yǎng)至生后30 d（P30）后用戊巴比妥鈉麻醉后放在冰盤上分離海馬組織，同樣用上述方法作各項(xiàng)相關(guān)檢測(cè)。
1.4 放射免疫法檢測(cè)cAMP水平 每只幼鼠海馬組織稱質(zhì)量后，放入盛有2 ml冷凍醋酸緩沖液 （50 mmol/L， pH 4.75）的試管內(nèi)，在冰上勻漿后加入 2 ml 無水乙醇，混勻，靜置5 min，3 500 r/min離心 15 min， 離心半徑為16.3 cm。60 ℃烘箱中烘干，4 ℃保存。測(cè)量時(shí)用1 ml醋酸緩沖液溶解后取 0.1 ml 檢測(cè)。檢測(cè)步驟及結(jié)果計(jì)算按照試劑盒要求操作。cAMP放免試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。
1.5 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄 P0和P30幼鼠中各收集3例分離海馬組織。將獲取的每只幼鼠海馬組織，按照Trizol試劑（北京賽百勝公司）說明一步法提取組織總RNA。取2 μl RNA經(jīng)RT反應(yīng)體系作用，在下列條件下合成cDNA:70 ℃ 5 min， 42 ℃ 60 min，94 ℃ 5 min。取RT產(chǎn)物1 μl對(duì)如下引物進(jìn)行PCR。Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha （pgc1α）引物序列為:上游引物，5'cacagattcaagccagtgctac3';下游引物，5'cggagagttaaaggaagagcaa3'。tfam引物序列為:上游引物，5'gaaacgcctaaagaagaaagca3';下游引物， 5'aagtccatgggctacagaaaaa3'。 GAPDH引物序列為:上游引物，5'aacaagtaaccctcaaccctg3';下游引物，5'acac-cctctgatacccacatt3'。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2.5 min。然后進(jìn)入以下29個(gè)循環(huán):94 ℃變性45 s，54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min。循環(huán)完畢，72 ℃延伸5 min中止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageTool軟件進(jìn)行目的條帶光密度分析。
1.6 mtDNA水平測(cè)定 將獲取的每只幼鼠海馬組織，按照試劑盒（上海杰美基因公司）說明提取DNA，并按照如下引物應(yīng)用PCR分別擴(kuò)增COX3、COX4和GAPDH。COX3引物序列為:上游引物， 5'atgaccactaacaggagcccta3' ;下游引物，5'taggggattta-aaggggtgatt3'。COX4引物序列為:上游引物， 5'ggactcagaactcaagggaca
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