藤黃酸HP-β-CD包合物凍干粉針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

【摘要】  目的  制備藤黃酸的HP-β-CD包合物凍干粉針,并初步考察藤黃酸包和物凍干粉針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用冷凍干燥法制備包和物，HPLC分析藤黃酸的體外釋放規(guī)律，并測(cè)定包合物凍干粉中藤黃酸的含量。結(jié)果 優(yōu)化的包合工藝制備的凍干粉針外觀形態(tài)，溶解性好, 用生理鹽水稀釋200毫升后在一個(gè)半小時(shí)內(nèi)釋放不超過(guò)20%,建立的含量測(cè)定方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便。結(jié)論 含量測(cè)定方法可行，包合及凍干工藝優(yōu)化合理。
【關(guān)鍵詞】  藤黃酸  包合物  質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
        1  藤黃酸的提取分離純化工藝
        1.1.1藤黃酸的提取
        稱取藤黃原料200g，加丙酮800ml，溫度控制在60℃左右，回流提取2 h，倒出上清液后繼續(xù)加600ml，400ml的丙酮，依次反應(yīng)2h，1h 回收多余溶劑，旋蒸提取物，再放置恒溫水浴鍋中蒸發(fā)至溶劑很少再置于真空干燥儀中得藤黃酸粗提物的干燥品132g。
        1.1.2藤黃酸吡啶鹽的制備
        稱取藤黃酸粗提物50g，加入吡啶85ml，于70℃水浴上加熱溶解，趁熱抽濾，濾瓶等容器用少量吡啶洗滌，合并洗液，濾液，量筒量取共計(jì)140ml。按以前探索的條件：100/13=140/X，X=18ml，加入溫?zé)嵴麴s水18ml，攪拌，放置冰箱中過(guò)夜，析出沉淀，抽濾得到橙紅色沉淀，70%吡啶洗3次共100ml，水洗3次，于60℃烘箱中烘干，得藤黃酸吡啶鹽40g。
        1.1.3藤黃酸的純化
        稱取藤黃酸吡啶鹽粗品40g，加入甲醇:乙酸乙酯=16：1的混合液85ml，80℃回流至完全溶解后，趁熱抽濾，濾液置冰箱中冷藏過(guò)夜，析出大量橘紅色沉淀，抽濾，濾餅烘干，得藤黃酸吡啶鹽精品21.5g。將重結(jié)晶得到的藤黃酸吡啶鹽用CH2Cl２溶解，依次由1N鹽酸,水洗至中性，合并有機(jī)層，無(wú)水Na2SO4,干燥，過(guò)濾，濾液于56℃旋蒸濃縮至少量，轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，于60℃真空干燥，得藤黃酸5.91 g。
        1.1.4自制藤黃酸的驗(yàn)證
        用熔點(diǎn)儀對(duì)制備的藤黃酸連續(xù)進(jìn)行三次熔點(diǎn)測(cè)定分別為： 82.4~83.1℃，82.6~83.0℃，82.1~83.7℃.與文獻(xiàn)值:80~83℃相符。
        2  不同濃度的HP－β－CD對(duì)藤黃酸的增溶作用
        依次配成濃度為4％、8％、12％、16％、20％、24％、28％、32％、36％、40％、44％、48％的HP-β-CD2ml的水溶液，另取1.2g藤黃酸溶于16mlC2H5OH。溫度控制在30℃-40℃，向上述不同濃度的HP-β-CD的溶液中逐漸滴加0.8ml藤黃酸的C2H5OH溶液，即每毫升溶液里面滴加30mg的藤黃酸，反應(yīng)24小時(shí)。溫度分別為室溫、40℃-50℃、50℃-60℃，其它條件不變進(jìn)行同樣的反應(yīng)，經(jīng)高效后觀察50℃~60℃的條件下增溶效果最好。50℃-60℃經(jīng)HPLC后結(jié)果。48％ 637563
        增溶試驗(yàn)結(jié)果表明HP-β-D對(duì)藤黃酸有增溶作用,相溶解度圖顯示出典型的AN型特征。一般AN型特征的藥物包合物的表觀穩(wěn)定常數(shù)不能計(jì)算或計(jì)算沒(méi)有意義。盡管包合機(jī)理復(fù)雜,包合物主客分子比較難以計(jì)算,但是可以肯定的是HP-β-CD可以與藤黃酸在溶液中形成包合物，屬于不穩(wěn)定包合，需要考慮稀釋穩(wěn)定性，所以加入L－精氨酸助溶[1]。
        2.2藤黃酸的包合
        依次配制濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%的2mlHP－β－CD水溶液。另取藤黃酸0.3g，用8ml無(wú)水乙醇溶解，溫度控制在50℃～60℃，分別向上述不同濃度的HP－β－CD溶液滴加0.8ml藤黃酸乙醇溶液，即每份溶液中加了30mg的藤黃酸，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入小安瓿瓶中，再用少量蒸餾水洗圓底燒瓶，一并倒入小安瓿瓶中，置冰箱中冷凍結(jié)冰
        2.3藤黃酸成鹽后的包合
        稱取L-精氨酸0.6g于小錐形瓶中，加入4 ml蒸餾水，攪拌溶解后，再分批加入藤黃酸0.12g，使之完全溶解。另取HP－β－CD0.9g、0.6g、0.3g于25 ml圓底燒瓶中，加入2ml蒸餾水使溶解，緩緩滴加上述L－精氨酸的藤黃酸溶液1ml，即HP－β－CD的濃度為30%、20%、10%的溶液，于50℃～60℃水浴中反應(yīng)8～9小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至小安瓿瓶中，置冰箱中冷凍結(jié)冰[2]。
        2.4凍干粉中藤黃酸含量測(cè)定的研究
        2.4.1藤黃酸成鹽后最大吸收波長(zhǎng)的確定
        取藤黃酸鹽溶液適量,加甲醇溶解并稀釋制成濃度約為10ug/ml，按分光光度法,在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)為365nm。
        2.4．2條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)   
        色譜柱：HypersilODSC18色譜柱（4.6mm×250mm，25 μm)；
        流動(dòng)相：甲醇-0.1%H3PO4(9∶1)；檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣        體積20 μL；柱溫為室溫。甘露糖衍生物峰理論塔板數(shù)計(jì)算不低于50000。 
        2.4.3藤黃酸成鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        配制2ml10％、20％、30％的HP－β－CD溶液，再配制15％的L－精氨酸溶液，使每毫升中含有30mg的藤黃酸，配制成鹽。在50～60℃條件下反應(yīng)8小時(shí)[3]，在反應(yīng)過(guò)程中緩緩加入上述鹽溶液1ml，反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)液稀釋100倍。

     2.4.2.4.4黃酸的含量測(cè)定
分別取3批號(hào)的凍干粉各五份，再用甲醇溶解并稀釋成合適的濃度超聲3次，每次20分鐘[4]，進(jìn)樣分析。
        2.4.5精密度試驗(yàn)  取一批片劑樣品用甲醇稀釋并超聲后連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD=0.65%。
        2.4.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)  對(duì)同一批片劑樣品按2.4.4中的方法重復(fù)平行測(cè)定5次，RSD=0.91%。
        2.4.7 回收率  取樣品兩份，一份用甲醇稀釋并超聲3次后定量加入藤黃酸對(duì)照品后測(cè)定含量，另一份不加對(duì)照品測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率分別為100.67%和98.34%，RSD分別為2.74%和3.22%(n=5)。
        2.5凍干粉用生理鹽水稀釋后藤黃酸體外釋放的規(guī)律研究
        配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、15%、20%、25%、30%的HP-β-CD的水溶液，分別滴加藤黃酸鹽溶液各1毫升（含藤黃酸30毫克），溫度控制在50℃～60℃下反應(yīng)8小時(shí),反應(yīng)液用生理鹽水稀釋成200ml之后，在一個(gè)半小時(shí)內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣7針，HPLC分析結(jié)果。
        第1針進(jìn)樣基本反映出反應(yīng)的包合率，當(dāng)HP-β-CD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20%時(shí)，包合率達(dá)到90%以上，在一個(gè)半小時(shí)內(nèi)從HP-β-CD中釋放出來(lái)的藤黃酸的量不超過(guò)25%,并且HP-β-CD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大釋放得越少。以體外釋放情況作為對(duì)包合工藝的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，最終確定了包合的優(yōu)化工藝條件為：HP-β-CD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，溫度50℃～60℃，反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)。
        3結(jié)果與討論
        HP－β－CD對(duì)藤黃酸有增溶作用，通過(guò)分析當(dāng)HP－β－CD的濃度在0～16％時(shí)，藤黃酸溶解度與HP－β－CD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，當(dāng)HP－β－CD的濃度在大于16％時(shí)，對(duì)藤黃酸的增溶作用增加不明顯。
        優(yōu)化的包合工藝的凍干粉在一個(gè)半小時(shí)內(nèi)從HP-β-CD中釋放出來(lái)的藤黃酸的量不超過(guò)20%，基本達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的。
        本實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法精密度高、重現(xiàn)性好。
參 考 文 獻(xiàn)
[1] 于大海,高坤,孫英華,等.那格列奈-2-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其理化性質(zhì)[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,24(8):465-469.
[2] 殷殿書(shū),蔣建蘭.紫杉醇透明質(zhì)酸注射用凍干制劑的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(11):839-841.
[3] 張慧穎,李學(xué)明,陳國(guó)廣,等.燈盞化素包和物凍干粉針劑的制備及安全性初步研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2007,42(6):457-460.
[4] 羅 蘭,孫殿甲,苗愛(ài)東.甲苯咪唑-β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,24(1) :66-67.

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