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親和超濾技術的研究進展
引言
傳統(tǒng)的分離和純化生物產(chǎn)物的方法很多，大都是利用其物理和化學性質的差異，如分子的大小、形狀、溶解度、帶電性質、等電點、親疏水性以及與其它分子的親和性等。而80年代誕生的親和超濾技術結合了親和層析與超濾技術共同特點，它既有良好的選擇性又易于大規(guī)模的操作，從而成為很有前途的分離純化技術。
1 親和超濾技術的基本原理及其操作體系
親和超濾[1]（Affility Ultrafiltration）是將連有特異性配基的載體（微粒或水溶性高聚物）在適當流動狀態(tài)下與目標初提液混合，親和上偶聯(lián)的親和配基特異性地與溶液中的目標物配合，形成體積及相對分子質量遠大于雜質的復合物。超濾時，復合物被超濾膜截留，而雜質則透過膜被除去，然后用合適的洗脫劑將結合的目標物洗脫下來，該目標物透過膜而得到分離純化的產(chǎn)品，親和載體則被截留循環(huán)使用。一般而言，親和超濾技術的體系關鍵是選擇合適的載體、特異性配體以及合適孔徑的超濾膜。
1。1 載體
親和超濾所用的載體有兩類，一類是水不溶性微載體，另一類是水溶性大分子載體。在親和超濾中，最吸引人的是可采用水溶性高分子為載體，這種聚合物可帶有對酶、蛋白質等起抑制作用或親和作用的官能團，這樣親和作用在均相中進行。水溶性高分子載體有許多優(yōu)點：親和載體與目標蛋白在均相體系中反應速度快，達到吸附或洗脫平衡的時間極短，吸附容量大。這一點對親和超濾很有利，可以將目標蛋白溶液與親和載體溶液，一邊混合，一邊進行超濾，而無需另備儲槽進行反應；洗脫時也一樣。 同時親和超濾技術也可選用小粒子載體，使其自由地懸浮在提取液中，從而增加了親和作用幾率，也防止了膜的濃差極化和堵塞現(xiàn)象。
1。2 配體（配基）
配基是親和過程的核心物質，在分離中起特異性吸附欲分離物的作用。配基一般分為天然配基（包括糖結合配基和蛋白質結合配基）、染料配基、氨基酸類親和配基、核苷酸及核苷酸類似物配基和仿生配基等幾類。配基與欲分離物吸附作用的大小主要與配基的空間結構有關，它們與載體的連接方法也關系到洗脫過程。但它們之間的結合力仍不外乎對應的功能基團之間的氫鍵、靜電作用、疏水作用等。
在親和超濾過程中，大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)要求吸附（親和） 和解吸迅速。 因此，配基與欲分離目標產(chǎn)物之間的親和力要控制在一定的范圍之內(nèi)，若親和力太低，則分離的效果不好；若親和力太高，則洗脫太困難。同時為了提高吸附量，配體必須有足夠的接觸面積（粒子盡可能小或呈多孔結構） 并且應廉價、專一性強，在親和洗脫條件下很穩(wěn)定，在高剪切力下無損傷，易回收、無毒。 若配體為小分子物質，則必須固定于載體表面。
1。3 超濾膜
超濾膜一般為高分子分離膜，是一種具有超級“篩分”分離功能的多孔膜。它的孔徑只有幾納米到幾十納米。在膜的一側施以適當壓力，就能篩出大于孔徑的溶質分子，以分離分子量大于500 道爾頓、粒徑大于2～20 納米的顆粒。超濾膜根據(jù)膜材料的不同，可分為無機膜和有機膜，而膜的結構則有對稱和非對稱之分。
親和超濾過程的透過速率由超濾膜的孔徑或截留分子量決定。選用截留分子量大的超濾膜可提高透過速率。由于超濾膜分離的選擇性較低，選用載體的分子量應至少比親和體的分子量大10 倍[2]。此外，超濾膜在使用過程中會受到吸附、沉淀和生物等污染，使得超濾膜化學清洗頻率較高，而且超濾膜的制造成本相對較高，膜壽命較低。上述問題，使得超濾膜工藝的運行能耗和運行成本中折舊費用增加，因此人們一直在不斷開發(fā)研究各種新型超濾膜[3—6]，以期滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
2 親和超濾技術和傳統(tǒng)的親和層析及過濾技術的比較
親和超濾技術是親和層析技術和超濾技術的有機結合，與這兩者相比，親和超濾技術在物質分離純化方面擁有自己獨特的特點。
2。1 親和超濾技術和傳統(tǒng)的親和層析技術的比較
親和層析[7]（Affinity Chromatography）是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產(chǎn)物，使目標產(chǎn)物得到分離純化的方法。它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要一步處理即可使待分離的生物大分子從復雜的混合物中分離出來，達到千倍以上的純化，并保持較高的活性[8]，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質的有力工具。
與傳統(tǒng)的親和層析技術相比，親和超濾在全混攪拌池中進行，全部起始物料同時參與親和載體結合，對可溶性載體或超細顆粒載體，反應能在瞬間達到平衡。由于可溶性載體配基與目標蛋白結合的空間位阻小，配基能較為有效地發(fā)揮作用，因而吸附容量大，能在短時間內(nèi)處理大體積物料。當物料比較稀，體積比較大時，采用親和超濾比親和層析更為合適。當被純化產(chǎn)物濃度高，體積小時，采用親和層析更為合適。
但親和層析常有如下問題[9] ：（1）層析柱易于阻塞和污染，使用壽命短；（2） 受基質限制， 柱效降低；（3）在層析過程中，底物被吸附和洗脫的過程緩慢，分離周期延長； （4） 某些配基與底物可存在多點的相互作用，這可能會造成峰分裂和不可逆吸附現(xiàn)象等。
2。2 親和超濾技術和傳統(tǒng)的超濾技術的比較
傳統(tǒng)的超濾過程是以壓力為推動力，溶質按分子量大小不同而分離，比膜孔小的溶質和溶劑（水）一起透過膜，而較大的溶質則被截留。這是一個非常簡單的過程，不包括相變化，不需要加入化學試劑，而且能耗小，易于大規(guī)模操作。如孫x等[10]用超濾法純化大黃多糖；夏光輝[11]將超濾技術應用于葡萄酒加工；劉春霞[12]等用超濾技術處理飲用水。但劉春霞等也指出：超濾技術選擇性差，不能將分子量相近的生物大分子分開。而親和超濾技術可以很好解決這一難題，親和配基（配體）能特異性的與目標產(chǎn)物相結合，與待分離物質分離。
3 親和超濾技術的應用
親和超濾技術可從稀溶液中專一地提純生物大分子。過程中不需要為了分離目標物而引入新的化學雜質和苛刻的操作條件，親和載體與目標產(chǎn)物具有很好的生物及化學相容性，可避免產(chǎn)品的生物活性受到損傷。親和作用在均相或微粒—液相體系中進行，吸附與洗脫擴散阻力小，所有親和載體同時參加吸附或洗脫過程，載體利用率和過程速率大為提高，可實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化操作。目前，親和超濾技術已經(jīng)在蛋白質分離、酶分離、手性拆分等領域獲得了廣泛的應用。
3。1 親和超濾在蛋白質分離方面的應用
蛋白質是生命的物質基礎，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質。純蛋白在食品，醫(yī)藥，化妝品等行業(yè)有著極其重要的作用。
Mattiason 等[13]利用熱殺死酵母細胞為載體，細胞表面存在的糖為配基，從刀豆中提取伴刀豆蛋白，用分子截留值30 萬—100 萬的超濾膜過濾，以葡萄糖為洗脫劑，最后得到純產(chǎn)品，收率為70%以上。Power 等[14]將生物素共價結合到平均粒徑為74nm 脂質體上，制成親和載體用于從含有溶菌酶和細胞色素C 的模擬雜質中分離抗生素蛋白，回收率為50%。
Rao 等[15]使用藍色染料為親和配基，再生纖維素膜共價結合一個磺酸基從而形成帶負電的過濾膜，通過兩者之間的靜電相互作用來分離牛血清白蛋白和卵蛋白。結果表明牛血清白蛋白純化了90 多倍，收率大于90％。并指出，使用小的帶電親和配體可提高蛋白質分離的潛力。
3。2 親和超濾在酶分離的應用
通常酶也是蛋白質，但酶又不完全等同于蛋白質，有著自己獨特的性質。酶的催化作用有如下特性：高效性、專一性、多樣性、溫和性。因此，酶的分離純化工藝往往更加苛刻。
Male 等[16]采用在無氧的條件下，經(jīng)N—丙烯酰—間— 氨基苯甲脒和丙烯酰胺共聚而成的聚合物作為大分子配體，采用親和超濾技術從人尿液中分離純化尿激酶。整個親和超濾過程尿激酶的收率為49 % ，所得的尿激酶的比活力接近于最高商品級。由于人尿液中還含有其它分子量很高的組分，因此需要在親和超濾分離純化尿激酶前，需要對其進行預處理[17]。
Teke 等[18]用親和超濾技術分離純化牛胰磷脂酶A2 （PLA2）。這種方法是基于殼聚糖—磷脂酰乙醇胺的合成樹脂為親和載體，在Ca2+存在條件下進行親和超濾，最后以EDTA 為洗脫劑，結果顯示該酶被純化79 倍，活性回收率為76。3％。
Luong 等[19]采用與Male 實驗用的相同大分子為配體，與提取液中的胰蛋白酶相互作用形成復合物，然后使用連續(xù)親和超濾技術，使胰蛋白酶—大分子配體復合物被截留而其它雜質則通過膜，用精氨酸或氨基苯甲脒對復合物進行洗提，從復合物中分離出胰蛋白酶。連續(xù)親和超濾技術從豬胰腺中分離純化胰蛋白酶的產(chǎn)率高，所得產(chǎn)品純度高。而Powers 等則采用改性脂質體作為大分子配體，以親和超濾技術來分離和純化胰蛋白酶。
Mukherjee 等[20]考察了聚醚膜和聚乙烯膜兩種不同的膜來分離純化胰蛋白酶的能力，比較了兩種膜（截留分子量均為30 kDa）的相對性能。研究表明：兩種膜在提取胰蛋白酶活性相近（聚醚膜為74％，聚乙烯膜為70％）的前提下，使用聚醚膜的總蛋白回收率（70％）是聚乙烯膜（46％）的的1。5 倍。在親和超濾的洗滌和洗脫階段，聚醚膜均比聚乙烯膜有利于持續(xù)進行蛋白質分離。
Vedajnananda[21]等進行了半連續(xù)—親和超濾分離純化胰蛋白酶的數(shù)學模擬。實驗使用再生纖維素膜（截留分子量：30 kDa）為超濾膜，大豆胰蛋白酶抑制劑為親和配體，從胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物中分離純化胰蛋白酶。實驗中二者的濃度為0。02 毫克/毫升，濃度比例一直維持在50：1，超濾的壓力在199。4—395。5 千帕范圍。結果：在160 秒內(nèi)，胰蛋白酶的濃度從超濾模擬系統(tǒng)中它的初始值下降至零，而胰凝乳蛋白酶的濃度下降到零則用了300 秒。從而證明了使用半連續(xù)—親和超濾分離純化胰蛋白酶的可行性。
3。3 親和超濾在手性拆分方面的應用
許多有機化合物分子都有“對映異構體”，即具有“手性”。如α—氨基酸，在碳連接有一個羧基、一個氨基、一個烴基和一個氫原子（或一個不同于前邊的烴基）。由于對映體之間理化性質的相近，分離和合成出純凈的對映體一直是人類夢昧以求的事業(yè)。目前親和超濾技術分離手性化合物的研究中以氨基酸的研究居多。
Poncet 等和Garnier 等[22]都采用牛血清蛋白作為大分子配體來拆分色氨酸消旋體，當溶液的pH 值為9 時，采用單級親和超濾技術分離出的D — 色氨酸的純度為91 % ， 整個過程拆分回收率為89 %。而Romero 等[23 ]采用相同的大分子配體來拆分色氨酸消旋體，采用二級親和超濾技術，則可使分離出的L — 色氨酸的純度大于90 % ，整個過程的回收率為60 %，并指出采用二級親和超濾技術可以有效的避免截留滯留物（復合物） 的累計，因此可獲得更高的提純倍數(shù)。
Overdevest 等[24]采用具有對映選擇性的膠束作為大分子配體，通過親和超濾技術來拆分苯丙氨酸消旋體。在該過程中，具有對映選擇性的膠束優(yōu)先與一種對映異構體結合而形成復合物，而未結合的對映異構體則通過超濾膜。
傾斜超濾技術可以連續(xù)不斷的去除濾餅， Iritani 等[25]使用親和傾斜超濾技術分離色氨酸對映體：以牛血清蛋白為立體選擇性配基，使用垂直放置的單通模式的中空纖維膜為超濾膜，在pH 值7 的條件下進行分離。結果表明：右旋色氨酸優(yōu)先和牛血清白蛋白結合，過濾速度與牛血清白蛋白的濃度相關，但并未受到濃縮物流速的影響，因為堆積于膜上的濾餅即使在很低的流速下也可以在重力的作用下被移除。
Romero[26]采用模擬系統(tǒng)分析親和作用力受溶液的pH 值和鹽的濃度的影響。實驗以牛血清白蛋白為親和配基來分離的D —和L —色氨酸對映體， 結果表明L —色氨酸和牛血清白蛋白的最大結合度是在pH 值為7 至10，在這個PH 范圍之類純化度顯著增加。
4 展望
親和超濾技術作為一種新興的分離純化技術，具有親和層析和膜過濾的優(yōu)點，不僅利用了生物分子的識別功能，而且操作簡單、易于放大，是現(xiàn)代分離工程的一項重要技術。對親和超濾進行的一系列研究結果表明，親和超濾技術具有較大的實際應用價值。另外，雖然親和過濾在分離純化酶和蛋白質等生物大分子方面的優(yōu)越性很多，但是其應用領域仍然不夠，特別是國內(nèi)的此方面分離科學研究，目前幾乎未見相關報道，亟待引起重視和發(fā)展。此外，親和超濾技術本身還有諸多疑難點，如減少非特異性吸附，載體的反復利用后的污染等問題尚待解決，相信隨著親和過濾技術的不斷完善，在不遠的將來會走上工業(yè)化應用之路。
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