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鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab抗體庫的構建
1 引言
柑桔潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一種國內外重大檢疫性病害，給世界柑桔產業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。病菌主要隨罹病種苗等繁殖材料遠距離傳播，生產上常用的銅基殺菌劑和抗生素制劑對其防效不佳[1]，探索柑桔潰瘍病的防治新途徑在目前和將來都具有重大意義�；蚬こ讨亟M單抗兼具治療和診斷雙重功能，利用抗原-抗體特異性結合原理，可用于人類疾病、植物病害的診斷、治療和預防。
近年來發(fā)展起來的噬菌體抗體庫技術使人們可以繞開細胞雜交瘤技術，直接從基因水平制備特異性單鏈抗體，由此開創(chuàng)了簡便、快速生產基因工程抗體的先河，被認為是繼雜交瘤技術后抗體生產技術的又一次革命[2,3]。20 世紀80 年代中期，Smith[4] 等提出了噬菌體展示技術，到90 年代初，Winter 等在前人的研究基礎上創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術，將噬菌體展示技術應用到抗體工程領域，徹底改變了制備抗體的傳統(tǒng)途徑，使抗體技術進入到了基因工程抗體時代。近年來噬菌體抗體庫技術已經(jīng)成功應用于醫(yī)學研究及疾病診斷方面，但應用在植物病害方面研究的報道卻寥寥無幾[5,6]。Fab 抗體是由抗體輕鏈片段及重鏈的Fd 段組成的，與單鏈抗體ScFv 相比，具有穩(wěn)定性更好的特點，且可直接在大腸桿菌中表達有活性的抗體，制備簡單，省去了復性等繁瑣的步驟。本研究采用噬菌體抗體庫技術，以經(jīng)過多次免疫的小鼠脾細胞mRNA 為基礎，擴增出抗體輕鏈及重鏈Fd 段分別連接到噬粒載體中構建噬菌體抗體庫，為后面的研究奠定基礎。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 實驗動物
6～8 周齡BALB/c 小鼠4 只，均購自第三軍醫(yī)大。
2.1.2 菌株及載體
噬粒 pComb3XSS 由美國Barbas 實驗室饋贈；Top10 F’、輔助噬菌體VCSM13 為本中心保存；大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重慶工學院饋贈。
2.1.3 試劑及耗材
TRIZOL 購自Invitrogen 公司；M-MLV 反轉錄酶購自Promega 公司；限制性內切酶SacⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連接酶均購自NEB 公司；其它試劑為國產分析純。
2.1.4 引物
參照美國 Scipps 研究所鼠源抗體庫構建的引物及《實用分子生物學操作指南》[7]設計簡并引物，由上海生工合成。
2.2 方法
2.2.1 動物免疫
將柑桔潰瘍菌用生理鹽水稀釋至 1×108CFU/ml，取0.5 ml 腹腔注射6～8 周齡BALB/c小鼠，每周免疫一次，免疫4 周后用ELISA 法測血清效價，加強免疫3 天后取脾，并用無菌注射器針柄在200 目的不銹鋼濾網(wǎng)中將脾臟分離成單個細胞，加入Eppendorf 中，離心去上清，用液氮速凍后70℃保存。
2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一鏈擴增
按照 Trizol 試劑盒說明書提取小鼠脾臟RNA，通過凝膠電泳及測OD 值確定RNA 的質量。以Oligo-dT 為引物反轉錄合成cDNA 第一鏈。
2.2.3 PCR 擴增輕鏈及重鏈Fd 段基因
通過溫度梯度摸索 PCR 反應條件為94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 10min，35 個循環(huán)，PCR產物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳驗證, 采用凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產物。
2.2.4 鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab 抗體庫的構建
將 κ 鏈基因 PCR 產物與 pComb3xss 分別用 SacⅠ/XbaⅠ消化，經(jīng)瓊脂糖電泳分離并純化回收, 取1.0 μg 載體片段與0.2 μg κ 鏈片段在80 μL T4 DNA 連接酶反應體系中進行連接反應, 經(jīng)沉淀回收后電擊轉化XL1- Blue 感受態(tài)細菌, 加入2 mL SOC，37℃、250rpm 培養(yǎng)1 h 后取少量鋪盤測定, 其余加入100 mL 含50 μg /mL 氨芐青霉素和10 μg/mL 四環(huán)素的 SB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜。提取質粒, 得到輕鏈庫。再分別將輕鏈庫與Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切后回收，按前法進行連接、轉化、細菌擴增及轉化子測定。在加入100mL SB 培養(yǎng)液1 h 后加入1 mL 約1012 pfu 的輔助噬菌體 VCSM 13，再培養(yǎng)2 h 后，加卡那霉素至70 μg/mL，37 ℃振蕩過夜。次日離心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min，4℃、9 000 r /min 離心20 min, 棄上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉淀, 12000 r /min 離心5 min, 棄去不溶性沉淀, 所得上清即為 Fab 噬菌體抗體庫。
2.2.5 陽性克隆的菌落PCR 鑒定及酶切鑒定
分別挑取 10 個輕鏈庫及 Fab 庫陽性克隆，經(jīng) PCR 初步鑒定后再分別用 SacⅠ/XbaⅠ及 SpeⅠ/XhoⅠ 雙酶切鑒定其重組率。
3. 結果與分析
3.1 總RNA 的提取
對提取的總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中總RNA 電泳條帶以28S rRNA 和18SrRNA 為主，用分光光度計測得總RNA 的OD260 / OD280 的比值為1. 8，濃度約為1μg/μL，顯示總RNA 質量好，無降解，符合試驗的要求。
3.2 輕鏈和重鏈Fd 段基因的擴增
以 cDNA 第一鏈為模板，分別以輕鏈和重鏈Fd 段基因的3′端引物和5′端引物進行PCR 反應，分別擴增出輕鏈和Fd 段。將PCR 產物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約680 bp 處可見明顯的擴增條帶(如圖2)，與理論值相符。M 為DNA 分子量標準MarkerⅡ, 1-7 分別為輕鏈基因的PCR 產物，8-10 分別為重鏈基因的PCR 產物。
3.3 輕鏈基因庫的構建
1μL 輕鏈重組噬粒的轉化細菌菌液鋪板克隆數(shù)為 1009 個，測定轉化效率為1×106，通過菌落PCR 法鑒定輕鏈重組質粒，電泳結果顯示 10 個克隆在680 bp 處都有條帶，均判定為陽性克隆，用SacI 和XbaI 對重組噬粒進行酶切反應再次驗證，酶切后產物電泳發(fā)現(xiàn)10 個克隆均有約4 kb + 680 bp 兩個條帶，判定為陽性克隆(如圖3)，由此計算重組率約為100%。
3.4 噬菌體Fab 抗體庫的構建
1μL 含抗體Fab 片段基因的重組噬粒轉化細菌菌液鋪板有2006 個克隆子，計算出轉化率約為2×106。隨機挑取10 個轉化后的克隆子，通過菌落PCR 法鑒定，其中有8 個菌落擴增出680 bp 的片段，判定為陽性克隆，用XhoI 和SpeI 對重組噬粒進行酶切反應再次驗證，酶切后產物電泳發(fā)現(xiàn)8 個陽性克隆均切出4 kb + 680 bp 兩個條帶，判定為陽性克隆（如圖 4），由此計算重組率約為80%，庫容量為1.6 ×106。經(jīng)過輔助噬菌體VCSM13 的超感染，在PEG 沉淀濃縮后，得到的上清即是噬菌體抗體庫，測得噬菌體抗體庫滴度為2.4×1011 cfu。
4 討論
隨著基因工程的不斷發(fā)展，一些小分子抗體在疾病的診斷治療方面越來越受到重視。但是在植物病害方面的應用卻比較少，目前本實驗室已經(jīng)得到了抗柑桔潰瘍病菌親和力較高的ScFv抗體[8]，但由于其穩(wěn)定性不夠，影響了實際應用，相比之下Fab抗體彌補了這一不足[9]。
在本研究中采用柑桔潰瘍病菌免疫的小鼠為建庫源，從理論上來說，已包含抗柑桔潰瘍病菌的各種抗體基因，而且在構建噬菌體抗體庫時，抗體重鏈基因和輕鏈基因之間的隨機組合進一步豐富了抗體對抗原識別的多樣性。 有研究表明，107個特異性抗體分子就能識別全部抗原決定簇的99%， 構建一個庫容為108 的組合噬菌體抗體庫，一般可以認為基本上包括了所有的抗體分子。目前所構建的各類抗體庫，庫容一般介于106-108[10]，我們構建的抗體庫，庫容為1.6×106，滴度為2.4×1011 cfu，基本達到建庫要求，能滿足多樣性的要求[11]。在以pComb3XSS為載體的噬菌體展示系統(tǒng)中，克隆位點下游含有有一個能夠編碼6個組氨酸的His-tag 序列，該序列可作為蛋白標簽來進行目的蛋白的檢測和純化，還含有一個琥珀終止子，在非琥珀抑制型的大腸桿菌中只表達目的蛋白，為后期的純化工作帶來方便。
構建過程中的諸多環(huán)節(jié)都可影響抗體庫的質量，載體的轉化效率是制約抗體庫容量和豐富性的重要因素之一。一般研究中都采用電穿孔法將重組DNA轉入宿主菌， 其轉化效率最高可達109-1010轉化子/μg DNA，但是如果在培養(yǎng)液中使用抗生素，電穿孔的轉化效率會顯著降低3-5個數(shù)量級。本研究中我們制備了超級感受態(tài)進行化學轉化，運用該方法一般情況下可以獲得2×108或者更高的轉化效率，比常規(guī)的CaCl2轉化法要高出2-3個數(shù)量級。在我們的實際應用兩次轉化中獲得了106-107的較好轉化效率，且轉化的結果比較穩(wěn)定。抗體基因的擴增是影響庫容量的另一個重要因素，其中輕鏈比較容易擴增，在56-58℃均可擴增出比較亮的目的條帶，但是重鏈Fd段的擴增相對困難一些，而且產率也沒有輕鏈基因的高，這可能與重鏈基因相對復雜有著重要關系。在克隆過程中，為盡量減少對重鏈基因的操作，增加抗體庫的多樣性，采用先連接輕鏈基因，后連接重鏈Fd段。
5 結論
本研究成功構建了滴度為2.4×1011 cfu 的鼠源抗柑桔潰瘍病菌噬菌體Fab 抗體庫，為進一步研究柑桔潰瘍病的防治工作奠定了堅實的基礎。
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