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納米羥基磷灰石-40%二氧化鋯生物陶瓷材料組織相論文
【關(guān)鍵詞】 羥基磷灰石 二氧化鋯 組織相容性
【摘要】 ［目的］評(píng)估納米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性。［方法］根據(jù)iso10993-1標(biāo)準(zhǔn)，采用細(xì)胞毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和體內(nèi)植入(90 d)試驗(yàn)對(duì)納米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性進(jìn)行評(píng)估。［結(jié)果］納米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料組織相容性的細(xì)胞毒性評(píng)分小于i級(jí)，細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制現(xiàn)象，無(wú)急性毒性反應(yīng)，無(wú)溶血反應(yīng)，體內(nèi)植入符合植入材料生物學(xué)評(píng)價(jià)要求。［結(jié)論］納米羥基磷灰石-二氧化鋯生物陶瓷材料具有良好的組織相容性，作為骨組織工程中生物支架材料具有廣闊臨床應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】 羥基磷灰石 二氧化鋯 組織相容性
histocompatibility evaluation of nano hydroxyapatite-40% zirconia composite bioceramic
li chao,tao shu-qing,zhou chang-lin,et al.
department of orthopaedics,the second affiliated hospital of harbin medical university,harbin 150086, china
abstract: ［objective］to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic. ［methods］according to the standard of iso 10993-1,cytotoxicity experiment,acute toxicity test,hemolysis test and in vivo implantation(90 days) test were conducted to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic.［results］the score of cytotoxicity experiment was lower than grade i,and there was no significant inhibition of cell growth,no acute toxic reaction or hemolytic reaction.and the in vivo implantation met the requirements of the biological evaluation of implant materials.［conclusion］nano hydroxyzpatie-zirconia composite bioceramic showed a good histocompatibility.it has a broad prospect as a biomaterial scaffold in the bone tissue engineering.
key words：hydroxyapatite; zirconia; histocompatibility
生物陶瓷是目前骨組織工程常用的支架材料，傳統(tǒng)的生物陶瓷材料由于粒徑較大，氣孔大，其脆性及彈性模量較大，影響了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［1］。由哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料學(xué)院與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科共同研究制備的納米羥基磷灰石-40%二氧化鋯(nano hydroxyapatite-40%zirconia，nano ha-40%zro2)陶瓷材料強(qiáng)度、硬度、韌性和超塑性上都得到提高，如在人工器官制造，臨床應(yīng)用等方面將比傳統(tǒng)陶瓷有更廣泛的應(yīng)用并具有極大的發(fā)展前景。本研究選用細(xì)胞毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)，植入實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)納米ha-40%zro2組織相容性，初步評(píng)價(jià)該材料應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料的制備與浸提液提取
ha／40%zro2、ha由哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料學(xué)院與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科共同研究制備，用溶膠-凝膠(sol-gel)法制成納米羥墓磷灰石粉粒(ha)［2］，然后將質(zhì)量比按60%納米ha+40%二氧化鋯比例配制，納米ha和二氧化鋯粉體經(jīng)充分研磨后得到納米羥基磷灰石／二氧化鋯復(fù)合粉體，采用熱壓低溫?zé)Y(jié)技術(shù)磨削制成3 mm×3 mm×5 mm長(zhǎng)方體。將經(jīng)過(guò)環(huán)氧乙烷滅菌的上述復(fù)合材料以1 g材料／5 ml介質(zhì)的比例，放入生理鹽水或小牛血中，37℃恒溫箱中靜置浸提72 h制備成ha／40%zro2浸提液，過(guò)濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法
采用l929細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，將細(xì)胞培養(yǎng)基配制1×104個(gè)／ml細(xì)胞懸液分注于96孔塑料培養(yǎng)皿中，每孔100 μl，每組每觀(guān)察期至少8孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后棄去原培養(yǎng)基，用pbs洗滌2次，試驗(yàn)組加入100 μl小牛血清浸提液，陰性對(duì)照組加入100 μl小牛血清，陽(yáng)性對(duì)照組加入64 g/l苯酚溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1、2 d和3 d。棄去培養(yǎng)皿中的浸提液和培養(yǎng)基，加入20 μl/孔的mtt液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，吸去原液，加入150 μl／孔二甲亞砜，振蕩10 min，在beckman du640紫外分光光度計(jì)以500 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度od值，并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖度(rgr)。rgr=(試驗(yàn)組od值-空白o(hù)d值)／(陰性對(duì)照組od值-空白o(hù)d值)
1.2.2 細(xì)胞毒性分級(jí)與判定
rgr≥100%評(píng)為0級(jí)；rgr在75%～99%之間評(píng)為i級(jí)；rgr在50%～74%之間評(píng)為ii級(jí)；rgr在25%～49%之間評(píng)為ⅲ級(jí)；rgr在1%～24%之間評(píng)為ⅳ級(jí)；rgr為0時(shí)評(píng)為v級(jí))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1或0級(jí)反應(yīng)為合格，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為ⅱ級(jí)反應(yīng)時(shí)需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為�！玽級(jí)反應(yīng)為不合格。
1.3 急性全身毒性試驗(yàn)
1.3.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法
將20只昆明小鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄各半，體重（20±2.0） g，隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用生理鹽水ha／40%zro2材料浸提液，對(duì)照組用生理鹽水，均以50 ml／kg劑量通過(guò)小鼠腹腔注射，觀(guān)察注射后24、48和72 h動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)。
1.3.2 結(jié)果評(píng)定
72 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)小于對(duì)照組為符合要求；實(shí)驗(yàn)組中40%死亡，或60%出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，或動(dòng)物普遍出現(xiàn)進(jìn)行性體重下降為不符合要求。
1.4 溶血試驗(yàn)
1.4.1 制備新鮮稀釋血
經(jīng)肘前靜脈抽取健康人(8人，男性)靜脈血4 ml，混入3.2%檸檬酸鈉緩沖劑0.4 ml，加入生理鹽水5 ml進(jìn)行稀釋即制備出新鮮稀釋血。
1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法
實(shí)驗(yàn)組取ha／40%zro2浸提液10 ml，陰性對(duì)照組取9 g/l生理鹽水10 ml，陽(yáng)性對(duì)照組取蒸餾水10 ml，每組各取8個(gè)試管，將所有試管放入37℃恒溫箱中水浴30 min，各試管內(nèi)分別加入新鮮稀釋血0.2 ml輕搖，37℃恒溫保留60 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液在紫外分光光度儀上測(cè)定545 nm處的光吸收度(a)。溶血率計(jì)算公式：溶血率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)／(陽(yáng)性對(duì)照組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)×100%
1.4.3 結(jié)果評(píng)定
溶血率<5%為合格；溶血率≥5%為不合格
1.5 肌肉內(nèi)種植實(shí)驗(yàn)
1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組及方法
選用wister大鼠40只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄各半，體重（220±25） g，隨機(jī)分為術(shù)后第7、15、30、90 d 4組，每組10只。將ha-40%zro2材料塊環(huán)氧乙烷消毒后備用。常規(guī)麻醉消毒，在大鼠脊柱右側(cè)1.0 cm處做切口，分離豎脊肌，于肌肉內(nèi)植入ha／40%zro2材料塊，縫合肌膜和皮膚。術(shù)后每日予以青霉素20萬(wàn)u肌注，連續(xù)3 d，于術(shù)后第7、15、30、90 d取材。
1.5.2 觀(guān)察指標(biāo)
大體觀(guān)察：觀(guān)察術(shù)后大鼠飲食、活動(dòng)、切口反應(yīng)；肉眼下觀(guān)察有無(wú)材料外露，材料表面的包膜形成情況、有無(wú)紅腫等。病理學(xué)觀(guān)察：術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)連同材料、包膜和樣品周?chē)?.5～1.0 cm厚的肌肉共同取出，常規(guī)he染色，每個(gè)標(biāo)本取3張切片。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察材料周?chē)ば纬汕闆r和組織反應(yīng)情況。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用spss 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
ha／40%zro2試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，od值均有增加，陽(yáng)性組od值無(wú)增加，空白組od值為0.041。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組同一時(shí)間組間比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有顯著性(p<0.01)。ha／40%zro2小牛血清浸提液對(duì)l929細(xì)胞的細(xì)胞毒性均為1級(jí)(表1)，符合國(guó)家醫(yī)用生物材料細(xì)胞毒性要求［2］。
2.2 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)小鼠均無(wú)死亡、進(jìn)食正常，無(wú)驚厥、呼吸抑制、腹瀉、運(yùn)動(dòng)減少和體重下降等不良反應(yīng)，評(píng)價(jià)屬無(wú)毒級(jí)。組間小鼠體重增加量比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)，小鼠體重增加量見(jiàn)表2。表1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)各組od值，rgr和細(xì)胞毒性分級(jí)分組培養(yǎng)24 hod值rgr（略）
2.3 溶血實(shí)驗(yàn)
ha／40%zro2浸提液組吸光度為0.040±0.003，陰性對(duì)照組吸光度為0.009±0.001，陽(yáng)性對(duì)照組吸光度為0.988±0.031，根據(jù)溶血率公式計(jì)算ha-40%zro2材料浸提液的溶血率為3.17%，溶血率<5%，符合溶血實(shí)驗(yàn)要求。
2.4 肌肉內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)
2.4.1 大體觀(guān)察
各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始進(jìn)食且活動(dòng)正常，創(chuàng)口無(wú)明顯出血、滲出，術(shù)后5 d創(chuàng)口愈合良好。未見(jiàn)皮膚破潰、植入物外露等現(xiàn)象。將包繞ha-40%zro2材料的組織切開(kāi)，術(shù)后第7、15 d時(shí)無(wú)明顯包膜形成，第30、90 d時(shí)可見(jiàn)包膜組織，包膜隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變薄。表2 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)體重變化情況（略）
2.4.2 組織病理學(xué)檢查
材料植入大鼠豎脊肌植入后7 d，試樣周?chē)梢?jiàn)以嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎性反應(yīng)，可見(jiàn)吞噬細(xì)胞，無(wú)囊壁形成（圖1）；植入15 d后試樣周?chē)猩倭渴戎行粤＜?xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和巨細(xì)胞；試樣周?chē)梢?jiàn)小血管與纖維母細(xì)胞增生，開(kāi)始形成疏松囊壁（圖2）；植入30 d后，試樣周?chē)梢?jiàn)少量淋巴細(xì)胞，試樣周?chē)梢?jiàn)纖維母細(xì)胞與膠原纖維，并已形成纖維囊腔結(jié)構(gòu)（圖3）；植入90 d后試樣周?chē)匆?jiàn)或僅見(jiàn)極少量淋巴細(xì)胞，纖維化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄（圖4）。
3 討論
生物陶瓷是目前骨組織工程常用的支架材料，常用的是以羥基磷灰石(hydroxyapatite，ha)粉料為原料［2］，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)即得到的生物羥基磷灰石陶瓷，由于其粒徑較大，氣孔大，其脆性及彈性模量較大，影響了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［3］。納米生物復(fù)合材料是將納米微粒與其他材料復(fù)合制成各種復(fù)合材料從而獲得許多優(yōu)良特征［4］。氧化鋯(zro2)具有良好的耐磨性、抗生理腐蝕性和好的生物相容性，而且其強(qiáng)度、斷裂韌性指標(biāo)也高于其他所有的生物陶瓷材料，作為第二相顆粒加入到ha涂層中可以顯著提高涂層材料的力學(xué)性能 ［5］。目前國(guó)內(nèi)外已制備出含有(10%～70%)zro2的納米羥基磷灰石復(fù)合材料［6］，其強(qiáng)度和韌性等綜合性能可達(dá)到甚至超過(guò)致密骨骼的相應(yīng)性能［7、8］。其zro2含量越高其力學(xué)性能提高越明顯，但由于金屬離子效應(yīng)，吸附在材料表面的組織生物分子的化學(xué)組成將會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。為探索在力學(xué)性能和組織相容性上達(dá)到平衡，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料學(xué)院與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科共同研究制備成ha／40%zro2，其在強(qiáng)度、硬度和韌性上都得到顯著提高。
當(dāng)生物材料植入人體后，材料周?chē)M織(組織細(xì)胞，水，離子和生物分子及其他物質(zhì)的體液)的組成是非常復(fù)雜的，表現(xiàn)的形式也多種多樣。組織相容性是指材料與活體組織之間相互容納的程度，即材料的植入或接觸對(duì)組織的組成，形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響［9］。目前，人們對(duì)生物材料與骨的相容性研究主要包括三部分：(1)用體外細(xì)胞培養(yǎng)法研究其細(xì)胞相容性；(2)用體內(nèi)種植實(shí)驗(yàn)研究其組織相容性；(3)臨床研究其組織相容性。
本實(shí)驗(yàn)測(cè)定hap2zro2復(fù)合陶瓷的生物學(xué)性能首先采用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，選用的四唑鹽(mmt)法是一種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其原理是活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源的mtt還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物(formazan)并沉積在活細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞對(duì)mtt不起作用，因此死亡細(xì)胞不會(huì)被染色。由于mtt結(jié)晶物形成量與細(xì)胞數(shù)呈正比，od值就能間接反映活細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)計(jì)算出不同濃度試驗(yàn)材料浸提液作用下的細(xì)胞增殖度，可以對(duì)該材料的細(xì)胞毒性作用作出可靠的定量評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示24 h、48 h后的各組ha／40%zro浸提液細(xì)胞毒性分級(jí)均為0級(jí)，72 h后的各組ha／40%zro2浸提液細(xì)胞毒性分級(jí)0或1級(jí)別，且與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，由此說(shuō)明ha／40%zro2無(wú)細(xì)胞毒性作用。
體內(nèi)植入試驗(yàn)可從宏觀(guān)和微觀(guān)水平來(lái)評(píng)價(jià)組織工程支架材料對(duì)組織的局部反應(yīng)，包括早期的炎癥反應(yīng)和隨后的纖維增生反應(yīng)。通過(guò)體內(nèi)植入試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，材料在大鼠肌肉內(nèi)埋植后，均未出現(xiàn)任何壞死、纖維化、異位骨化和囊性改變。鏡下可見(jiàn)在早期(7 d)出現(xiàn)以嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的急性非特異性炎癥反應(yīng)，多由于手術(shù)創(chuàng)傷、繼發(fā)性微生物侵入引起的細(xì)菌性炎癥或者植入物抑制局部的免疫應(yīng)答能力而產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)。植入15 d后，材料周?chē)戎行粤＜?xì)胞減少，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、巨細(xì)胞，轉(zhuǎn)入慢性無(wú)菌性炎癥表現(xiàn)，并可見(jiàn)纖維母細(xì)胞與膠原纖維，開(kāi)始形成疏松囊壁。植入30 d后，炎癥反應(yīng)明顯減輕并伴有纖維增生反應(yīng)，植入90 d后，炎癥反應(yīng)基本消失，纖維化囊壁致密且較初期薄。說(shuō)明材料對(duì)正常組織已無(wú)刺激作用。符合植入物正常病理變化及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［10］，說(shuō)明ha／40%zro2與周?chē)M織有良好的相容性。
在臨床方面研究其組織相容性，采用的全身急性毒性試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果提示由于ha和zro2為惰性材料，其在生物體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)組成元素溶出，因此不會(huì)因材料可溶性殘余分子的化學(xué)作用導(dǎo)致生物體急性反應(yīng)及溶血作用，說(shuō)明ha／40%zro2無(wú)全身急性毒性及溶血反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)表明納米羥基磷灰石-40%二氧化鋯生物陶瓷材料具有良好的組織相容性，考慮到其力學(xué)性質(zhì)的優(yōu)越性，其作為骨組織工程增韌材料、關(guān)節(jié)和口腔修復(fù)材料具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。在臨床應(yīng)用之前，該納米生物材料還需進(jìn)一步研究遺傳毒性及長(zhǎng)期植入試驗(yàn)，觀(guān)察長(zhǎng)期植入生物體內(nèi)后復(fù)合材料的化學(xué)、力學(xué)穩(wěn)定性及材料微小顆粒溶解情況，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
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