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談一測多評(píng)法測定黃連及其炮制品中6種生物堿論文
黃連為毛茛科(Ranunculaceae)黃連屬CoptisSalisb.植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teeta Wall. 的加工品，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其化學(xué)成分主要為生物堿類物質(zhì)。黃連的廣泛利用與其所含各種生物堿的藥理作用有密切的關(guān)系，且研究表明，黃連的藥理作用并不是某單一生物堿作用的結(jié)果，如黃連中小檗堿具有較強(qiáng)的抗炎作用，但是黃連水提液的最低抑菌能力要強(qiáng)于小檗堿，說明黃連中含有其他抗菌或?qū)咕袇f(xié)同作用的成分。所以，只有對(duì)其主要的多個(gè)生物堿(如小檗堿、黃連堿、非洲防己堿、表小檗堿、巴馬汀等)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行全面控制，才能保證藥材的質(zhì)量。但對(duì)照品來源限制了多個(gè)生物堿的含量控制。有研究者提出了一測多評(píng)的多指標(biāo)質(zhì)控模式，即在多指標(biāo)質(zhì)量控制時(shí)，利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，以藥材中對(duì)照品廉價(jià)易得的典型成分為內(nèi)標(biāo)，建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子，再通過校正因子同步計(jì)算出其他成分的量。在方法實(shí)施時(shí)，可在只有一個(gè)對(duì)照品的情況下，實(shí)現(xiàn)這些成分的同步測定，并成功應(yīng)用于薄荷，五味子，白芷、丹參、赤芍、淫羊藿、連翹、黃芩、黃連、人參和枳實(shí)等藥材的質(zhì)量控制，以及熱毒寧注射液、復(fù)方丹參、清開靈注射液等中成藥的質(zhì)量控制。其中黃連藥材的一測多評(píng)方法被《中國藥典》2010 年版采用，但只對(duì)其中4 種生物堿進(jìn)行了控制。同時(shí)測定黃連中6 種生物堿更有利于黃連藥材質(zhì)量的控制。本研究采用一測多評(píng)的方法同時(shí)檢測黃連中6 種生物堿的量，相較于《中國藥典》方法增加指標(biāo)成分的種類，不受對(duì)照品來源的限制，更有利于黃連及其炮制品的質(zhì)量控制。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀(Waters 2695-2998，Agilent1200S，島津LC-20A);KQ5200 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CPA225D 型電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司);BS224S 型電子天平(萬分之一，德國賽多利斯公司)。對(duì)照品鹽酸巴馬汀(批號(hào)110732-200506)、鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-200609)由中國食品藥品檢定研究院提供;對(duì)照品鹽酸藥根堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.17%)、鹽酸非洲防己堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.41%)、鹽酸表小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.38%)、鹽酸黃連堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.92%)由重慶市中藥研究院藥化室提供;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。黃連 Coptidis Rhizoma 藥材(批號(hào)2008004、080803、080805、080804、2008005、20120905、080810、2008008、2008007、2008006)，黃連飲片Coptidis Rhizoma decoction pieces(批號(hào)20080501、0808003、080802、080801、0801101、0809021、0803180、060401、2008007、0801005、08031801、080101)，酒黃連Coptidis Rhizoma stir-fried withwine(批號(hào)071224、080301、080301、071124、080805、080301、08032101、080401、080804、20081001)，萸黃連Coptidis Rhizoma stir-fried withEvodiae Fructus(批號(hào)20080301、080313、071201、080301、080805、080301、08032101、20080401、080804 、20081001 )， 姜黃連Coptidis RhizomaStir-fried with ginger juice(批號(hào)080301、080313、080804、08032101、071130、080401、080301、080803、080805、20081001)，以上藥材及炮制品均由太極集團(tuán)有限公司提供;云連Coptis teeta Wall.和三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao(雅連)自采，各3 批，以上藥材均由江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍研究員鑒定。
2 方法與結(jié)果
2.1 一測多評(píng)方法學(xué)考察
2.1.1 對(duì)照品溶液的配制
精密稱取鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿各適量，用50%乙腈制成含有11.13 μg/mL 鹽酸藥根堿、15.2 μg/mL 非洲防己堿、52.77 μg/mL 鹽酸表小檗堿、100.93 μg/mL 鹽酸黃連堿、75.32 μg/mL 鹽酸巴馬汀、284.2 μg/mL 鹽酸小檗堿的混合對(duì)照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備
取藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙腈-鹽酸(100∶1)50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙腈-鹽酸(100∶1)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，加各溶劑至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
2.1.3 色譜條件
色譜柱為Gemini-NX C18(250mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.25 mol/L 乙酸銨和8 mmol/L 十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH 值為9.3)(36∶64);柱溫35 ℃;體積流量1 mL/min;檢測波長270 nm;進(jìn)樣量10 μL。上述色譜條件下，鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿分離良好，各組分的理論塔板數(shù)均>7 500。
2.1.4 線性關(guān)系的考察
將混合對(duì)照品溶液依次稀釋2、4、8、16、32、160 倍，精密吸取混合對(duì)照品溶液及其稀釋液各10 μL 進(jìn)樣。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行線性回歸處理，得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的回歸直線方程及線性范圍。
2.1.5 精密度試驗(yàn)
取鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液，各重復(fù)進(jìn)樣6 次，測得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積的RSD 依次為0.59%、0.37%、0.44%、0.20%、0.28%、0.14%。表明有較好的精密度。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批次的樣品6 份，照上述制定的方法制備供試品溶液和進(jìn)行HPLC 測定，測得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.50%、0.45%、1.13%、2.38%、1.68%、7.20%，RSD 依次為1.00%、0.91%、0.76%、0.49%、0.69%、0.36%。表明該法重復(fù)性良好。
2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積，結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的RSD依次為0.81%、0.96%、0.57%、0.40%、0.43%、0.15%。說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取適量已測定的黃連藥材粉末約0.1 g，精密稱定，共6 份，加入混合對(duì)照品溶液適量，按供試品制備方法制備樣品進(jìn)行HPLC 測定，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率依次為99.65%、98.59%、98.49%、98.66%、98.64%、98.63%，RSD依次為0.03%、0.15%、0.21%、0.12%、0.28%、0.23%。
2.2 相對(duì)校正因子的確定
2.2.1 相對(duì)校正因子計(jì)算
以鹽酸小檗堿為內(nèi)標(biāo)(S)，分別計(jì)算鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride，B)對(duì)鹽酸藥根堿(jatrorrhizine hydrochloride，J)、鹽酸非洲防己堿(columbamine hydrochloride，C1)、鹽酸表小檗堿(epiberberine hydrochloride，E)、鹽酸黃連堿(coptisine hydrochloride，C2)、鹽酸巴馬汀(palmatine hydrochloride，P)的相對(duì)校正因子(fs/k)，結(jié)果見表2。2.2.2 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察考察了3種高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 2695-2998、島津LC-20A 和Agilent 1200S 型高效液相色譜儀和3 種色譜柱：Gemini-NX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，XtimateTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，BETASIL C18(250mm×4.6 mm，5 μm)并進(jìn)行了不同實(shí)驗(yàn)室的考察，鹽酸小檗堿對(duì)鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的fs/k 均基本一致，RSD 小于2%，其結(jié)果比較穩(wěn)定可靠。
2.2.3 待測組分色譜峰的定位
利用相對(duì)保留值(rk/s)定性，測得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的rk/s ，RSD≤5%，表明利用rk/s 進(jìn)行峰的定位可行。rk/s=tR(k)/tR(s)k 為待測組分，s 為對(duì)照物。
2.3 一測多評(píng)法和外標(biāo)法的比較
取各批次黃連及其炮制品樣品粉末，按照供試品溶液的制備方法制備樣品，分別注入液相色譜儀，測定樣品中鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量;并運(yùn)用小檗堿對(duì)藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的相對(duì)校正因子計(jì)算藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的量，各批次每個(gè)樣品測定3 次，取均值，再計(jì)算各類型黃連及其炮制品的總平均值。將一測多評(píng)與外標(biāo)法得到的量值進(jìn)行比較，2 種方法所得值的偏差都在3%以內(nèi)，由此說明一測多評(píng)法用于黃連藥材及炮制品的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的。
3 討論
黃連供試品制備方法中對(duì)溶媒種類進(jìn)行了考察，文獻(xiàn)中黃連的提取溶媒多用甲醇或甲醇-鹽酸，在黃連質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，發(fā)現(xiàn)50%乙腈對(duì)生物堿的溶解度較大，因此，對(duì)比了甲醇與50%乙腈做溶媒對(duì)黃連中主要生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，結(jié)果表明50%乙腈-鹽酸(100∶1)為提取溶劑時(shí)6 種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高�！吨袊幍洹�2010 年版一部對(duì)黃連制定了4 種生物堿的量限度，但文獻(xiàn)已有關(guān)于黃連中5 種或5種以上生物堿HPLC 法同時(shí)測定的報(bào)道，其中包括木蘭花堿、Groenlandicine、藥根堿、非洲防己堿等;多成分測定符合中藥多成分的特點(diǎn)，有利于中藥質(zhì)量控制的整體性和客觀性。因此，本課題組考察了流動(dòng)相系統(tǒng)，建立了分離度及對(duì)稱因子都較好且穩(wěn)定的6 種生物堿測定的HPLC 方法;在對(duì)其檢測波長的選擇上，參考文獻(xiàn)和PDA 檢測器主要生物堿的紫外吸收?qǐng)D譜，6 種生物堿在270 nm 及345 nm處均有最大吸收，但考慮到木蘭堿在345 nm 下無吸收，而在270 nm 下，出峰數(shù)量較多且基線穩(wěn)定;因此，檢測波長定為270 nm。
為防止上述各項(xiàng)測定結(jié)果出現(xiàn)遠(yuǎn)離均數(shù)的極端值，分別采用統(tǒng)計(jì)方法中的格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)法和狄克遜(Dixon)檢驗(yàn)法對(duì)黃連6 種生物堿量的最大值和最小值進(jìn)行檢驗(yàn)，舍去可疑值;并采用各生物堿均值的20%下限制定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度，黃連及其炮制品的不合格數(shù)據(jù)基本集中于同一來源的藥材，其量差異與藥材的產(chǎn)地和炮制習(xí)慣有關(guān)。雅連和云連中生物堿成分的量與味連相比差異較大，其藥根堿量較高，約為味連中藥根堿量的2倍;但其非洲防己堿、表小檗堿、巴馬汀量較味連低;黃連堿量與味連一致。故在確定黃連生物堿限度時(shí)，未將二者計(jì)算在內(nèi)，單獨(dú)列出，加以區(qū)分。
本研究6 種生物堿的測定方法，與《中國藥典》2010 年版一部黃連的測定方法相比，符合中藥多成分的特點(diǎn)，有利于中藥質(zhì)量控制的整體性和客觀性，更符合中藥質(zhì)量控制方法的要求，對(duì)黃連及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。
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