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羊松果體細胞原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究
松果體為哺乳動物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官，產(chǎn)生多種胺類和肽類物質(zhì)，下面是小編搜集整理的一篇探究羊松果體細胞原代生物特性的論文范文，歡迎閱讀查看。
摘要：體外培養(yǎng)山羊及綿羊的松果體細胞，觀察其增殖情況和功能狀態(tài)的變化。結(jié)果顯示：山羊、綿羊的松果體細胞體外形態(tài)及生長情況相似。細胞多呈圓形或多角形，細胞體積有增大趨勢。采用MTT了法檢測細胞生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞有明顯的增殖現(xiàn)象，大約于11d達到高峰，用免疫組織化學(xué)對培養(yǎng)細胞進行染色，發(fā)現(xiàn)5-HT陽性細胞數(shù)量隨細胞的增殖而增加。表明山羊和綿羊松果體細胞在體外均增殖旺盛，并能保持體內(nèi)的分泌功能。
關(guān)鍵詞：松果體細胞培養(yǎng);M9了;5-HT免疫組化
松果體為哺乳動物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官，產(chǎn)生多種胺類和肽類物質(zhì)，其主要分泌物--褪黑素(MT)對許多器官的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了解松果體的生理價值，許多學(xué)者采用體外培養(yǎng)技術(shù)研究其細胞形態(tài)和分泌功能.體外構(gòu)建松果體組織并植入動物體內(nèi)成為目前研究的熱點，這些研究有助于深入了解松果體的活動特點，為進一步調(diào)節(jié)動物體內(nèi)松果體細胞分泌的研究積累材料。
哺乳動物松果體細胞培養(yǎng)早在20世紀70年代國外就有報道，1977年Rowe首次觀察了體外培養(yǎng)大鼠松果體細胞的形態(tài)，1978年Budat成功檢測了培養(yǎng)的大鼠松果體細胞褪黑素合成和分泌功能。本實驗以山羊和綿羊作為研究對象，對其松果體進行體外培養(yǎng)，觀察在無其他因素干擾條件下山羊和綿羊松果體細胞的形態(tài)變化、增殖過程和功能狀態(tài)的異同，為研究松果體細胞分泌特點及改變動物繁殖現(xiàn)狀提供依據(jù)。
l材料與方法
1.1主要實驗試劑及儀器
DMEM培養(yǎng)液(GIBCO，美國)，M199培養(yǎng)液(sigma，美國)，犢牛血清(sigma，美國)，胰蛋白酶(sigma，美國)，雙抗(武漢亞法)，MTr(sigma，美國)，DMSO(國產(chǎn)分析純)，兔抗5-HT血清(武漢博士德)，SABC試劑盒(武漢博士德)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，自動酶標儀(Tecan，澳大利亞)，C02培養(yǎng)箱(LAB―LINE，美國)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)。
1.2松果體細胞的體外培養(yǎng)
按伊斯蘭方法屠宰1歲齡健康萊蕪黑山羊6只、小尾寒羊5只，分別進行以下步驟：迅速開顱取出松果體，冷D-hank昌液沖洗;剪碎后，0.25%膠原酶消化30min，含血清培養(yǎng)液中和，反復(fù)吹打，離心;加完全培養(yǎng)液吹打混勻，按每mL1xl04的細胞密度分別接種于96孔培養(yǎng)板(分7組，每組6孔)和24孔板(分7組，每組3孔，每孔內(nèi)置一蓋玻片)，放人37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。另外，本
實驗中山羊采用DMEM培養(yǎng)液，綿羊采用M199培養(yǎng)液。
1.3MTT法檢測細胞增殖
從培養(yǎng)第3d開始，隔日取96孔板內(nèi)一組細胞，每孔加入MTY15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入DMSO30gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。處測吸光度值并繪制曲線。
1.45-HT免疫組織化學(xué)方法24孔板每組從第3d開始隔日取出細胞爬片，PBS沖洗，冷95%乙醇固定10min;用正常羊血清在室溫下封閉30rain;加入兔抗5―HT血清(1：100)37℃孵育2h，然后4℃過夜，PBS沖洗3rainx3;加入生物素標記的IgG，37℃30min，PBS沖洗3minx3;SABC復(fù)合物37℃下作用30rain，PBS洗3minx3;DAB鏡下顯色5～10Min;蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片觀察。
2結(jié)果
2.1松果體細胞的形態(tài)觀察
倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的山羊、綿羊松果體細胞形態(tài)相似，大多呈圓形或多角形，x400下觀察呈圓圈狀。培養(yǎng)過程中都可見到“8”形的細胞形態(tài)，可能為正處于細胞分裂期。培養(yǎng)后期，細胞體積略增大，折光性減弱，但形態(tài)變化不大。另外可見具有長突起的小膠質(zhì)細胞(圖1、2)。
2.2MTT檢測結(jié)果
從表1和圖3可以看出，體外培養(yǎng)的松果體細胞數(shù)量前7d增長緩慢，第9d開始分裂增殖速度加快，于第11d左右達到高峰，此后生長曲線開始緩慢下降。
2.3.5-HT免疫組化染色結(jié)果
不同培養(yǎng)時期都可見細胞爬片上布滿棕黃色的5-HT陽性細胞，培養(yǎng)后期細胞的陽性反應(yīng)仍然明顯，松果體細胞多呈圓形或多角形，高倍鏡下細胞中陽性物質(zhì)呈不均質(zhì)分布，細胞輪廓無明顯界限，復(fù)染后核位于細胞中間，呈規(guī)則的圓形(圖4、5)。培養(yǎng)前期隨時間延長，陽性細胞數(shù)有增加現(xiàn)象;在11d細胞增殖達高峰后，陽性細胞數(shù)量變化不大。
3討論
1)體外條件下培養(yǎng)山羊、綿羊的松果體細胞形態(tài)相似，初期呈小圓形、折光性強，后期細胞逐漸增大、折光性減弱，這與廖華對大鼠松果體細胞的報道基本一致。
2)MTT比色法是一種檢測細胞增殖情況的經(jīng)典方法，酶標儀所測的OD值可反映出細胞的相對數(shù)量。從測量OD值得出的生長曲線可見，兩種羊雖在不同培養(yǎng)液中生長，但其增殖趨勢相同，松果體細胞在培養(yǎng)第9d開始增殖，11d左右達到高峰，隨后增長緩慢。證明松果體細胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下，能保持其增殖能力，細胞數(shù)目明顯增加，而在成年動物體內(nèi)，松果體細胞與神經(jīng)元一樣，數(shù)目恒定且很難再生。對于一特定動物來說，隨著年齡的增長松果體細胞開始退化，同時也沒有新生的細胞出現(xiàn)，因此松果體這一器官將逐漸衰老而無法發(fā)揮其功能。本實驗發(fā)現(xiàn)體外松果體細胞表現(xiàn)出明顯的增殖現(xiàn)象，說明體外構(gòu)建松果體組織用于解決細胞的更新問題渴望成為可能。
3)褪黑素是松果體細胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多種酶的作用下轉(zhuǎn)化而成，因此檢測轉(zhuǎn)化過程中的任一中間產(chǎn)物或酶都可反映細胞的功能狀態(tài)，本實驗采用目前常用的5―羥色胺免疫細胞化學(xué)染色，因為5-羥色胺作為MT的前體與MT的分泌有著密切的關(guān)系，可初步判斷松果體細胞的功能狀態(tài)。我們對培養(yǎng)不同時期的細胞爬片進行抗5―羥色胺免疫細胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)爬片上布滿陽性細胞，細胞中含有大量呈點狀的陽性顆粒，細胞多為圓形和不規(guī)則形，陽性細胞數(shù)量隨細胞總數(shù)的增加而增加。證明體外增殖的松果體細胞具有合成5-HT，分泌MT的能力。
4)本研究所選的實驗動物山羊、綿羊均為季節(jié)性繁殖動物，光周期是影響其生殖活動的主要環(huán)境因素。松果體分泌的褪黑素在光周期感受過程中處于調(diào)控的中心地位，褪黑素主要通過與下丘腦-垂體―性腺軸的相互作用達到動物生殖周期與環(huán)境光周期的同步變化。實驗證明體外構(gòu)建的松果體組織具有旺盛的增殖和分泌能力，因此可以考慮給動物植入新的松果體，并人為控制細胞的分泌狀態(tài)，延長動物的繁殖季節(jié)，以達到增加繁殖率的目的。同樣其它季節(jié)性繁殖動物如藏羚羊等瀕臨滅絕物種也可采用該方法來提高種群數(shù)目。通過本課題的研究，我們可以為人工繁殖稀有動物提供一個新的思路。
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