食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中沙門菌屬LAMP檢測方法的應(yīng)用效果分析
Loop-mediated isothermal amplification 縮寫為LAMP， 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一門新興的基因擴(kuò)增技術(shù),作為一種分子生物學(xué)檢測技術(shù),具有高特異性、高敏感性、簡單、便捷及成本低的特點(diǎn),已廣泛用于臨床疾病的診斷、流行性細(xì)菌或病毒的定性定量檢測、動物胚胎性別鑒定及基因芯片開發(fā)等領(lǐng)域。
摘要：目的：分析沙門菌屬LAMP在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果。方法：擇取2015年2月-11月的食品標(biāo)本142份，通過LAMP以及分離培養(yǎng)法對其進(jìn)行檢測與鑒定，對比兩組檢測結(jié)果。結(jié)果：通過LAMP檢測所得結(jié)果中，陽性率顯著優(yōu)于分類培養(yǎng)鑒定結(jié)果，數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0、05);應(yīng)用LAMP進(jìn)行檢驗(yàn)，可以通過加熒光染料染色法判斷結(jié)果;LAMP檢測時(shí)間不超過24h，而分離培養(yǎng)鑒定時(shí)間在4d-7d左右。結(jié)論：應(yīng)用LAMP法對食品進(jìn)行檢測，不僅具有較高的沙門菌屬陽性率，而且檢測周期較短，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值顯著，值得廣泛推廣。
關(guān)鍵詞：食品衛(wèi)生檢驗(yàn) LAMP檢測方法 應(yīng)用效果 沙門菌屬
沙門菌是誘發(fā)人體種類細(xì)菌性食物中毒的主要因素。現(xiàn)階段，檢測沙門菌的主要方法為分類培養(yǎng)法，該方法雖然具有較好的準(zhǔn)確性，但操作程序十分繁瑣，免疫學(xué)法并不具較好的敏感度，而PCR雖然具有較高的敏感度以及特異度，但在設(shè)備方面具有較高的要求，推廣限制較大。LAMP屬于新興核酸擴(kuò)增法，具有特異性強(qiáng)、快速以及簡單等優(yōu)勢。本次試驗(yàn)主要通過對比分析分類培養(yǎng)法與LAMP法在食品沙門菌屬方面的檢測效果，進(jìn)而探析LAMP法的應(yīng)用價(jià)值。
一、資料與方法
1、一般資料
擇取2015年2月-11月的食品標(biāo)本142份，其中，有6分生食類蔬菜、8份鮮榨果汁、8份沙拉、10份冰激凌、10份生水產(chǎn)品、20份速凍米面、20份非發(fā)酵豆制品、20份熟肉、20份生鮮肉以及20份冷凍生肉。以腸炎沙門菌為參考菌株。
2、檢測方法
取25g食品標(biāo)本置于無菌均質(zhì)袋內(nèi)，以拍擊式均質(zhì)器進(jìn)行拍打，2min后停止，將其置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)10h，冷凍食品置于45℃環(huán)境中解凍15min。
對標(biāo)本行分離培養(yǎng)法檢測：在10mlTTB增菌液中接種1ml增菌后標(biāo)本，然后置于42℃中對其進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)長為24h。另在101mlSC增菌液中接種1ml增菌后標(biāo)本，在37℃環(huán)境中培養(yǎng)4h。各取1杯增菌液，分別進(jìn)行XLD平板與BS平板接種，于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h。擇取3個(gè)可疑菌落，進(jìn)行賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板以及TSI接種，于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h。如果生化反應(yīng)與沙門菌特征相符，取出營養(yǎng)瓊脂平板中的可疑菌落，通過生理鹽水，配制為菌懸液，然后通過微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行分析。如果XLD平板、BS平板中不存在可疑菌落，繼續(xù)將BS平板置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h，如檢測仍不存在可疑菌落，則為陰性。
對標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測：取1ml標(biāo)本前增菌液，對其進(jìn)行離心處理，離心率為每分鐘10000r，共2min，排除上清提取核酸;另取上清液1l，制成DNA待檢模板，對食品標(biāo)本進(jìn)行DNA檢測，反應(yīng)后，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色，如果呈現(xiàn)綠色，則為陽性;如果呈棕色，或是無色，則為陰性。
3、觀察指標(biāo)
觀察兩種檢測方法的陽性率。
4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
本次實(shí)驗(yàn)過程中，以SPSS19、0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對兩種檢測方法所涉及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中計(jì)數(shù)的資料用n(%)表示，數(shù)據(jù)的組間比較以χ2進(jìn)行檢驗(yàn);計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，數(shù)據(jù)的.組間比較以T進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0、05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)。
二、結(jié)果
LAMP檢測方法的陽性率為11、27%，分離培養(yǎng)法的陽性率為4、23%，數(shù)據(jù)組間比較差異明顯，即P<0、05，詳情見表1：
三、討論
由各種類型沙門菌引發(fā)不同形式的野生禽獸、家畜以及人體感染，被統(tǒng)稱為沙門菌病。帶菌者，或是感染沙門菌人的糞便會在一定程度上污染食物，導(dǎo)致人體食物中毒。沙門菌極易導(dǎo)致人體發(fā)生細(xì)菌性食物中毒，主要表現(xiàn)有敗血癥、腸胃炎以及腸傷寒等，而且具有一定的傳染性，可以通過消化道致病。LAMP檢測法是新興恒溫核酸擴(kuò)增法，根據(jù)靶基因所具有的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)出來4種特異引物，通過特定鏈對DNA聚合酶進(jìn)行置換處理，然后將其置于恒溫條件下45min左右，促使其產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)。相對比PCR而言，LAMP在模板方面并不存在紫外觀察、電泳、溫度循環(huán)以及熱變性等要求，不僅簡單快捷，具有非常強(qiáng)的特異性，而且檢測范圍相對較大，檢測靈敏度較好，在實(shí)際應(yīng)用過程中，不需要借助特定儀器設(shè)備，便可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快捷且高通量檢測，成本較低，經(jīng)濟(jì)性能顯著。
細(xì)菌分離培養(yǎng)法操作程序較為復(fù)雜，檢測速度比較緩慢，基本上，需要檢測7d后，才能獲取陽性結(jié)果，而且分離細(xì)菌后，還要UI器進(jìn)行增菌與再分離培養(yǎng)，生化鑒定過程中繁瑣，且成本較高，難以實(shí)現(xiàn)普及。LAMP可以直接提取前增菌液內(nèi)的核酸，60min中便可以完成對其的擴(kuò)增操作，沙門菌屬檢出時(shí)間不會超過24h，效率非常高。不僅如此，應(yīng)用該方法可以通過肉眼直接觀察檢測結(jié)果，具有非常顯著的直觀價(jià)值與便捷性。
通過本次實(shí)驗(yàn)可知，LAMP檢測法與分離培養(yǎng)法檢測結(jié)果的陽性率差異非常顯著，LAMP檢測陽性率為11、27%，分離培養(yǎng)法檢測的陽性率為4、23%，數(shù)據(jù)比較P<0、05，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。
四、結(jié)語
應(yīng)用LAMP法對食品進(jìn)行檢測，不僅具有較高的沙門菌屬陽性率，而且檢測周期較短，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值顯著，值得廣泛推廣。
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