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靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)粉狀畢赤酵母研究
摘 要：通過混合因子設(shè)計，以粉狀畢赤酵母最大生物量為參照，比較了在以靈芝菌糠懸濁液為主要成分的液體培養(yǎng)基中，菌糠濃度、菌糠處理方式、玉米粉添加量三者對粉狀畢赤酵母生長的影響，初步考察了經(jīng)膨化處理的菌糠和未經(jīng)處理的菌糠之間的區(qū)別，得到了經(jīng)優(yōu)化的靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)基，其最優(yōu)配方為膨化靈芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，經(jīng)由52 h培養(yǎng)后，粉狀畢赤酵母的最大生物量為4.527×1010 CFU・mL-1。
關(guān)鍵詞：菌糠;培養(yǎng)基;膨化;畢赤酵母
在食用菌栽培生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了大量含有菌絲體的培養(yǎng)基質(zhì)，在栽培結(jié)束后，這種被稱為菌糠(Waste medium of fungi culture，WMFC)的培養(yǎng)基廢料的處理問題一直是食用菌栽培中的重要問題，尤其在近年來我國食用菌栽培的規(guī)模已經(jīng)十分可觀的情況下，產(chǎn)生的廢棄菌糠以萬t計[1]。食用菌菌糠中含有大量來自于所栽培食用菌菌絲體的多糖和菌體蛋白，以及尚未利用的培養(yǎng)基成分，營養(yǎng)價值上超越了作物秸稈，甚至于和麩類[2-3]以及玉米粉[4]相當。因此，將食用菌菌糠作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，拓展工業(yè)微生物培養(yǎng)基的原料來源，在實際生產(chǎn)上具有重要的意義。
由于菌糠來源于食用菌栽培培養(yǎng)基，大部分營養(yǎng)成分已經(jīng)被食用菌所利用，或轉(zhuǎn)化成菌絲成分，或轉(zhuǎn)化為具有化感作用的代謝產(chǎn)物，使得菌糠對于同種或異種食用菌菌絲體有明顯的抑制作用[5-6]。其中，大部分為食用菌的細胞壁成分，為結(jié)構(gòu)復雜的雜多糖類物質(zhì)[7]。因此，通過擠壓膨化處理這種物理手段，對其菌糠進行預加工，以期改變原有的糖類、纖維類物質(zhì)的組成，并去除化感物質(zhì)，不失為一種廉價而有效的處理廢棄菌糠的方法。
因此，本研究以靈芝菌糠以及膨化處理后的靈芝菌糠作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，進行培養(yǎng)畢赤酵母的初步研究，為食用菌菌糠的新的利用方式提供理論依據(jù)，并驗證膨化處理方式在食用菌菌糠處理方面的可行性。
1 材料和方法
1.1 菌 種
粉狀畢赤酵母Pichia farinosa，編號FL7，引自天津大學化工學院，分離自天津市林業(yè)果樹研究所實驗基地所采集的食用菌菌糠廢棄物堆肥，使用0.5 mL YEPD液體培養(yǎng)基[8-9]分裝于1 mL聚丙烯離心管中于4 °C冰箱保藏。
1.2 原料及處理
菌糠懸濁液培養(yǎng)基的制備采用以下2種經(jīng)過不同處理的靈芝菌糠。
普通靈芝菌糠：取赤芝Ganoderma lucidum栽培結(jié)束，子實體已采收后所余含有菌絲體及剩余培養(yǎng)基之菌糠，經(jīng)粉碎機粉碎后，過孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
膨化靈芝菌糠：將普通靈芝菌糠經(jīng)雙螺桿擠壓機膨化處理后[10]，冷卻并粉碎，過孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
玉米粉：取超市所售玉米粉過孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
1.3 培養(yǎng)基
(1)種子培養(yǎng)基。采用YEPD液體培養(yǎng)基作為酵母種子培養(yǎng)基，具體配方如下：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.0。將上述成分分別溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH值并定容后，分裝20 mL加于50 mL廣口三角瓶中，棉塞封口后于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻后備用。
(2)測試培養(yǎng)基。靈芝菌糠懸液培養(yǎng)基測試選取靈芝菌糠濃度、菌糠處理工藝、輔料玉米粉添加量3因子，設(shè)計全因子試驗，因子和水平及培養(yǎng)基各處理配比見表1，所有處理以及CK對照組皆設(shè)3個重復。 取50 mL廣口三角瓶，除對照組CK外，按表1中各處理對應的因子和水平加入靈芝菌糠、玉米粉和蒸餾水后，玻棒攪動至玉米粉和菌糠均勻分散，不經(jīng)調(diào)節(jié)pH值，棉塞封口后于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻后取出，超凈臺內(nèi)晾干表面殘水后備用。各處理皆設(shè)3個重復。
(3)對照及計數(shù)培養(yǎng)基。與種子培養(yǎng)基相同的YEPD培養(yǎng)基作為測試培養(yǎng)基的對照組CK，測試培養(yǎng)基，亦設(shè)3個重復，配方及制備方式同1.1。計數(shù)培養(yǎng)基為YEPD固體瓊脂平板。如上述YEPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g・L-1，于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min后傾注90 mm平板備用。
1.4 培養(yǎng)方法
種子的制備：取制備好的YEPD液體培養(yǎng)基，以100 μL移液槍接入保藏酵母菌種10 μL，置于恒溫搖床中，160 r・min-1，25 °C培養(yǎng)48 h后立即使用。
測試培養(yǎng)基的接種：以YEPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)48 h的畢赤酵母菌液作為種子，于超凈臺上振蕩混勻后以移液槍吸取菌液接入各處理中，每瓶接種10 μL。搖勻后，置于恒溫搖床中，160 r・min-1，25 °C避光培養(yǎng)。
經(jīng)由預備試驗，通過血球計數(shù)板進行活菌計數(shù)[11]，確定培養(yǎng)基中的酵母最大生物量大致出現(xiàn)在培養(yǎng)52 h之后。因此，在酵母培養(yǎng)至第48 h后，每隔約4 h取樣，取樣時將三角瓶移入超凈臺中，用振蕩器充分搖勻發(fā)酵液，移液槍吸取10 μL發(fā)酵液注入預先滅菌并干燥后的1 mL聚丙烯離心管中。各處理及其重復同一時間點取樣各1次，并記錄準確取樣時間。取樣后重新加棉塞，移入恒溫搖床繼續(xù)培養(yǎng)，重復上述過程直至各培養(yǎng)基發(fā)酵至72 h。
1.5 計數(shù)方法
采用梯度稀釋―微量點樣法[12]進行酵母活菌計數(shù)。具體操作如下：將含有取樣樣品的聚丙烯離心管中加入90 μL無菌蒸餾水，振蕩器充分混勻后即為發(fā)酵液10-1梯度。從此離心管中再取10 μL再加入新離心管中，以移液槍加入90 μL無菌蒸餾水，以振蕩器充分混勻后即為發(fā)酵液10-2梯度，以此類推至10-15為止。
使用移液槍將上述各梯度稀釋液分別吸取10 μL，按稀釋度的大小順序點樣于1.3所述YEPD瓊脂平板上，不加涂布，任其自然形成稀釋液的圓型斑點。各稀釋度點樣3次重復。點樣后靜置平皿待稀釋液已被平皿瓊脂表面吸收后，加蓋并標記各點樣處所對應的稀釋倍數(shù)和測試培養(yǎng)基編號，放置于25 °C恒溫箱避光靜置培養(yǎng)48 h。
菌落形成后，對各稀釋梯度斑點中的酵母菌落進行手工計數(shù)和統(tǒng)計。為避免系統(tǒng)誤差，僅選取菌落數(shù)量大于3個小于40個的稀釋梯度進行發(fā)酵液中酵母活細胞數(shù)的計算。若有1個以上的稀釋液斑點滿足上述規(guī)則，則對比二者之間的比值，若比值小于等于2即取平均數(shù)，若比值大于2則只記錄稀釋倍數(shù)較大、菌落總數(shù)較小的斑點;若所有稀釋液斑點中的菌落數(shù)均大于40則以最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算;若菌落數(shù)均小于3則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算;若都不存在菌落則以1乘以最小稀釋倍數(shù)計算。
以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)來表示活酵母生物量，以CFU・mL-1用以表示各處理發(fā)酵液中的活酵母生物量，計算公式：
CFU= ×10n
式中，CFU為每毫升發(fā)酵液中的活酵母菌落形成單位，CFU・mL-1;v為點樣樣品體積，mL;N為樣品斑點中的酵母菌落數(shù);n為N所對應的樣品稀釋次數(shù)。
以上所得各處理3個重復中各個發(fā)酵液中平均活酵母數(shù)，按日期匯總后，原始數(shù)據(jù)錄入EXCEL軟件，為計算方便，將全部數(shù)據(jù)換算成以e為底數(shù)的自然對數(shù)值ln CFU・mL-1，輸入SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 畢赤酵母的最大生物量
測試培養(yǎng)基各處理中，畢赤酵母的最大生物量平均值(同處理的3個重復)如表2。
2.2 方差分析
將表2所述各處理及其3個重復所得最大生物量數(shù)據(jù)，錄入統(tǒng)計軟件SPSS19.0軟件進行方差分析。選取因子A為3水平組內(nèi)因子，因子C為2水平組內(nèi)因子，因子B為2水平組間因子，使用一般線性模型的重復度量模式進行方差分析，得到方差分析表如表3。
由表3組間因子與組內(nèi)因子方差分析可見，主效應中，因子A靈芝菌糠濃度，因子B菌糠處理方式，因子C玉米粉添加量三者均達到極顯著(P<0.01)水平，但以上3個因子的二階交互作用，A×B，即靈芝菌糠濃度×菌糠處理方式;A×C，即靈芝菌糠濃度×玉米粉添加量;B×C，即菌糠處理方式×玉米粉添加量，亦達到極顯著(P<0.01)水平，因此各因子主效應對試驗結(jié)果的影響并無統(tǒng)計學意義，尚需要對各因子進行簡單主效應分析。其中，因為三階交互作用A×B×C，即靈芝菌糠濃度×菌糠處理方式×玉米粉添加量不顯著(F=3.748，P >0.05)，因此不進行各因子的簡單交互作用和簡單效應分析。
2.3 交互作用和簡單效應分析
在SPSS19.0軟件中的syntax模式即語法模式下，使用EMMEANS命令，手動編程對各因子進行簡單效應分析，并對各因子及水平進行兩兩比較。所用代碼見參考文獻[11]，此處不再贅述。將代碼以及數(shù)據(jù)錄入SPSS后，所得結(jié)果整理如表4的各因子簡單效應分析表。
2.3.1 靈芝菌糠濃度與菌糠處理方式的簡單效應分析 由表4中因子A對因子B的簡單效應分析和兩兩比較可以看出，因子A在A1水平下對因子B的2個水平簡單效應顯著，且B2>B1，即在0.010 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠要優(yōu)于未處理菌糠;在A2水平下對因子B簡單效應不顯著，即在0.050 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠和未處理菌糠并無區(qū)別，A3水平下，因子A對因子B的2水平又出現(xiàn)了簡單效應顯著，同樣B2>B1，即在0.100 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠要優(yōu)于未處理菌糠。同時，在因子B對因子A的簡單效應分析和兩兩比較可以看出，因子B在B1水平下對因子A的3個水平簡單效應顯著，且A3>A2>A1，即未處理菌糠的不同濃度對酵母的生物量有明顯的影響，且隨菌糠濃度的增大而增大;在B2水平下僅與A3水平簡單效應顯著，A3>A2，A1，即膨化菌糠在0.010 g・mL-1的濃度下和0.050 g・mL-1的濃度下酵母生物量并沒有區(qū)別，在濃度至0.100 g・mL-1時，酵母的生物量較低濃度有明顯增加。
綜上，菌糠濃度對酵母生物量的影響與菌糠的不同處理方式密切相關(guān)，經(jīng)過膨化處理的菌糠在0.100 g・mL-1濃度下培養(yǎng)的解磷酵母生物量最大。至于在0.050 g・mL-1濃度下為何處理方式不同的菌糠，以及不同處理方式的菌糠在0.010 g・mL-1與0.050 g・mL-1下不存在顯著性差異，一個可能的解釋是與不同處理的菌糠中所含有的速效/遲效碳源、氮源的比例以及二者不同的碳氮比有關(guān)，但這尚需進一步的試驗。
2.3.2 靈芝菌糠濃度與玉米粉添加量的簡單效應分析 由表4中因子A對因子C的簡單效應分析和兩兩比較可以看出，因子A在A1水平下對因子C的2個水平簡單效應不顯著，即在0.010 g・mL-1菌糠濃度下，添加玉米粉與否并無明顯區(qū)別;在A2水平下對因子C的2水平簡單效應顯著，且C2>C1，即在0.050 g・mL-1菌糠濃度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉對酵母生物量有明顯的促進;在A3水平下，對因子C的2水平簡單效應顯著，但相反的C1>C2，即在0.100 g・mL-1菌糠濃度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉反而對酵母生長產(chǎn)生了抑制，生物量反而減少。同時，在因子C對因子A的簡單效應分析和兩兩比較可以看出，因子C在C1水平下對因子A的3個水平簡單效應顯著，且A3>A2，A1，即未添加玉米粉的靈芝菌糠，僅在0.100 g・mL-1濃度對酵母的生物量有明顯的影響，這與因子B對因子A的簡單效應的結(jié)論相同;在C2水平下因子A的3水平簡單效應顯著，A3>A2，A1，即在添加0.010 g・mL-1玉米粉的情況下，不同濃度的靈芝菌糠對酵母的生物量仍然隨菌糠濃度的增大而增大。
綜上，玉米粉添加量對酵母生物量的影響受菌糠濃度的制約，只有在0.050 g・mL-1的菌糠濃度下才有促進生長的作用，這顯然和玉米粉加入后改變了培養(yǎng)基的碳氮比有關(guān)。在添加玉米粉的情況下，酵母的生物量隨靈芝菌糠的濃度增大而增大。
2.3.3 菌糠處理方式與玉米粉添加量的簡單效應分析 因子B在B1水平下對因子C的2個水平簡單效應不顯著，即對未處理菌糠而言，添加玉米粉對酵母生長并無促進;在B2水平下對因子C的2個水平簡單效應顯著，C2>C1，即在膨化菌糠中添加0.010 g・mL-1玉米粉要顯著優(yōu)于不添加的，經(jīng)過膨化處理的菌糠和玉米粉配合良好，也從一個側(cè)面說明培養(yǎng)基中的碳氮比和速效遲效碳源氮源的比例，膨化和非膨化的菌糠是不同的。因子C對因子B的簡單效應分析與上述相同。
3 結(jié) 論
在此試驗體系下，靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為膨化靈芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，蒸餾水，經(jīng)由52 h培養(yǎng)后，粉狀畢赤酵母的最大生物量為4.527×1010 CFU・mL-1，遠高于YEPD培養(yǎng)基的8.987×109 CFU・mL-1。
兩種不同處理的菌糠在0.100 g・mL-1濃度下培養(yǎng)的解磷酵母生物量最大，在0.050 g・mL-1濃度下對酵母生物量的影響近似。
玉米粉添加量對酵母生物量的影響受菌糠濃度的制約，只有在0.050 g・mL-1的菌糠濃度下才有促進生長的作用，在添加玉米粉的情況下，酵母的生物量隨靈芝菌糠的濃度增大而增大。
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