基于熒光成像的生命科學(xué)論文
1.激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)，具有除目鏡與物鏡之外的圖片放大功能，可以隨時(shí)采集和記錄檢測(cè)信號(hào)，觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化。其選擇單色性較好的激光作為光源，從根本上消除了色差。物鏡的焦平面上加了一個(gè)帶孔擋板，阻擋了焦平面外的雜散光，進(jìn)一步消除色差。樣品被分解成二維或三維空間上的無數(shù)個(gè)點(diǎn)，激光束逐個(gè)掃描成像，進(jìn)而組成整體的平面或立體圖像，計(jì)算機(jī)代替肉眼或照相機(jī)進(jìn)行觀察或攝像，數(shù)字化的圖像在電腦中進(jìn)一步處理，提高了圖像的清晰度。該儀器還使用了光電倍增管，將微弱的信號(hào)放大，大大提高了靈敏度。由于以上優(yōu)點(diǎn)，激光共聚焦顯微鏡可以應(yīng)用到幾乎所有有關(guān)細(xì)胞研究的領(lǐng)域。如原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)的生物大分子，觀察細(xì)胞或亞細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；無損傷實(shí)時(shí)檢測(cè)分析活細(xì)胞，并研究其形態(tài)和功能；在一個(gè)樣品上同時(shí)進(jìn)行多重標(biāo)記，實(shí)時(shí)觀察等。
2熒光探針
熒光探針在熒光成像技術(shù)中占據(jù)舉足輕重的地位。一般熒光探針需具備優(yōu)良的光物理性質(zhì)，以便于激發(fā)和檢測(cè)，且不與生物基質(zhì)同時(shí)被激發(fā)，還要有較高的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)。熒光探針的溶解度要大，便于溶于緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中，且熱、光性質(zhì)比較穩(wěn)定，有特異性標(biāo)記位點(diǎn)。熒光探針需要具有良好的生物相容性，易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。熒光探針大致分為兩類，包括化學(xué)類和生物類。化學(xué)類包括有機(jī)染料、納米材料（金納米粒子、半導(dǎo)體量子點(diǎn)等）及金屬配合物等。生物類包括藻膽蛋白、分子燈標(biāo)及基因編碼熒光蛋白等。熒光探針在化學(xué)、光學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但是，目前仍缺少有效的分子探針識(shí)別疾病分子水平上的獨(dú)特位點(diǎn)，故從分子水平上進(jìn)行病理研究比較困難。
3熒光成像技術(shù)的應(yīng)用
3.1蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測(cè)
生物體的生理狀態(tài)可以通過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來，生命活動(dòng)離不開各種酶的作用，而酶大多是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，故研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能在認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過程中至關(guān)重要。劉亭延等采用熒光成像技術(shù)構(gòu)建了一種檢測(cè)人血清蛋白質(zhì)的新方法。該方法以碳量子點(diǎn)為標(biāo)記染料，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出人血清蛋白，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，最終得到清晰的電泳圖。段相國等建立了一種ＨＣＶＮＳ３／４Ａ蛋白酶在小鼠體內(nèi)瞬間表達(dá)的模型。金屬離子在生物學(xué)中起重要作用，金屬離子與熒光探針結(jié)合，在熒光顯微鏡下可觀察細(xì)胞內(nèi)金屬離子的變化。Ｍｉｃｈａｅｌ等選用Ｉｎｄｏ－１為模板，合成了一系列檢測(cè)Ｃａ２＋的熒光探針，可用于確定活細(xì)胞中特定位置的Ｃａ２＋濃度。Ｓａｒｅ等合成了Ｚｎ２＋的熒光探針，并應(yīng)用到細(xì)胞中Ｚｎ２＋的檢測(cè)識(shí)別中。人們還建立了Ｍｇ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｃｄ等離子的檢測(cè)模型。熒光成像技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)金屬離子檢測(cè)還存在一些問題，如有的`熒光探針不能通過細(xì)胞膜、成像過程對(duì)細(xì)胞造成損害、檢測(cè)方法不統(tǒng)一等，因此，建立統(tǒng)一、低損害的熒光成像檢測(cè)技術(shù)仍是極具挑戰(zhàn)性的研究課題。
3.2腫瘤疾病的檢測(cè)和診斷
目前，腫瘤的臨床診斷主要依賴于顯微形態(tài)學(xué)觀察，從而在細(xì)胞層面上了解腫瘤細(xì)胞的類型與個(gè)體差異，這就要求檢測(cè)手段不斷進(jìn)步。熒光成像技術(shù)以其操作方便、標(biāo)記靶點(diǎn)多、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腫瘤跟蹤成像研究中，具有廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。高苒等建立了一種小鼠腫瘤模型，利用熒光顯微鏡和活體熒光成像儀可直接從整體和細(xì)胞水平上觀察腫瘤，了解宿主與腫瘤間的作用。至今為止，人們對(duì)此進(jìn)行了深入的探討和研究，但該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)需要考慮復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，動(dòng)物組織會(huì)產(chǎn)生背景噪音，影響該技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用。
3.3藥物新劑型研究
為了提高藥物療效，降低毒副作用，發(fā)展藥物新劑型尤為重要。熒光探針的不斷發(fā)展使熒光成像技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，可用于對(duì)藥物運(yùn)輸過程、細(xì)胞屏障跨越方式、藥物釋放過程等的觀測(cè)研究，它的迅速發(fā)展也大大促進(jìn)了藥物新劑型研究的迅速發(fā)展。陳剛等研究了熒光探針經(jīng)內(nèi)耳給藥后的轉(zhuǎn)運(yùn)通路，在熒光成像系統(tǒng)下追蹤了整個(gè)運(yùn)輸過程。鐘華等構(gòu)建了一種裝載抗癌藥物阿霉素的新型納米膠囊，采用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)跟蹤觀察藥物投遞釋放過程，為新劑型的研究提供了理論平臺(tái)。目前，類似的研究雖然較多，但仍處于理論研究階段，諸如熒光探針毒性、生物體內(nèi)相容性等問題還沒有解決，沒有合理的規(guī)范，難以規(guī)模化生產(chǎn)。
4結(jié)論與展望
熒光成像技術(shù)的迅速發(fā)展加深了人們?cè)诜肿铀綄?duì)生命科學(xué)的了解，生命科學(xué)的研究也進(jìn)一步推進(jìn)了熒光成像技術(shù)的發(fā)展。激光共聚焦顯微鏡操作簡單，應(yīng)用廣泛，熒光探針易于制備，熒光信號(hào)強(qiáng)，熒光成像技術(shù)可用于蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測(cè)，在腫瘤等疾病的檢測(cè)中也起著重要作用，還可以實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)給藥過程，為藥物新劑型的研究提供新的平臺(tái)。目前，熒光成像技術(shù)仍存在許多不足，主要為：細(xì)胞在可見光區(qū)有自發(fā)熒光，掩蓋了標(biāo)記分子信號(hào)；難以實(shí)現(xiàn)對(duì)分子的長期標(biāo)記檢測(cè)。熒光成像技術(shù)是基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用間的重要紐帶，三者將相互促進(jìn)，不斷進(jìn)步。
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