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探討不同的胞外基質(zhì)對(duì)ES細(xì)胞分化的影響
胚胎干細(xì)胞具有無(wú)限增殖和多向分化的特性，下面是小編搜集整理的一篇探究不同胞外基質(zhì)對(duì)ES細(xì)胞分化影響的論文范文，供大家閱讀查看。
胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ES細(xì)胞)在體外可分化為3個(gè)胚層的所有細(xì)胞[1],定向誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞,可以為造血干細(xì)胞移植提供新的細(xì)胞來(lái)源.目前誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化多采用ES細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以及擬胚體的方法[2,3],但是這兩種方法分化效率均比較低,而且存在動(dòng)物源性污染,離臨床應(yīng)用距離甚遠(yuǎn).本研究采用人ES細(xì)胞在胞外基質(zhì)上直接貼壁培養(yǎng)向造血細(xì)胞誘導(dǎo),既沒(méi)有擬胚體復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu),又不受基質(zhì)細(xì)胞的影響,從而排除異源性污染,旨在建立人ES細(xì)胞分化為造血祖細(xì)胞的簡(jiǎn)單高效的誘導(dǎo)體系,并探討不同的胞外基質(zhì)對(duì)其分化的影響.
材料和方法
主要材料和試劑
人胚胎干細(xì)胞系PKU1.1由北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心陳貴安教授饋贈(zèng),為PKU1連續(xù)傳代30代后建立的單細(xì)胞克隆亞系,染色體核型為46,XX[4].KnockOutTMDMEM培養(yǎng)液、KnockOutTM血清替代品(SR)和IMDM培養(yǎng)液以及胞外基質(zhì)Fibronectin和CollagenIV均為美國(guó)Gibco/Invitrogen公司產(chǎn)品;Matrigel為美國(guó)BectonDickson公司產(chǎn)品;細(xì)胞因子均為美國(guó)PeproTech公司產(chǎn)品;HIT(人血清白蛋白+重組人胰島素+人轉(zhuǎn)鐵蛋白)和甲基纖維素培養(yǎng)液MethoCult4435+為加拿大StemCellTech-nology公司產(chǎn)品;流式抗體均為美國(guó)BectonDicksonPharmingen公司產(chǎn)品;MiniRNA提取試劑盒為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品;SYBRGreenSuperMix為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;引物合成由北京奧科公司完成.
胞外基質(zhì)預(yù)處理培養(yǎng)板
設(shè)立3組:分別將Matrigel、Fibronectin和CollagenIV置于4℃融化,以預(yù)冷的IMDM按1∶20比例稀釋.各取2ml均勻鋪于6孔培養(yǎng)板,37℃孵育2h,吸出后以IMDM清洗1遍,待用.
人ES細(xì)胞直接貼壁培養(yǎng)分步向造血干/祖細(xì)胞誘導(dǎo)第1步將生長(zhǎng)5-6d后的人ES細(xì)胞經(jīng)Dispase酶消化后,以基礎(chǔ)分化培養(yǎng)液(IMDM+HIT+MTG+谷氨酰胺+非必需氨基酸)重懸,按2×104細(xì)胞數(shù)/cm2的密度接種至胞外基質(zhì)預(yù)先包被過(guò)的6孔培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)液中同時(shí)添加細(xì)胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4,25ng/ml)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF,20ng/ml)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF,10ng/ml)誘導(dǎo)7d;第2步更換細(xì)胞因子為干細(xì)胞因子(SCF,50ng/ml)、芙萊基3配體(Flt3L,50ng/ml)、白介素3(IL-3,10ng/ml)和白介素6(IL-6,10ng/ml)繼續(xù)誘導(dǎo)分化7d,共誘導(dǎo)14d.每3d更換新鮮的培養(yǎng)基和細(xì)胞因子.在倒置相差顯微鏡下觀察分化細(xì)胞的形態(tài).將人ES細(xì)胞在未經(jīng)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)且不添加細(xì)胞因子設(shè)為對(duì)照組.
造血集落形成試驗(yàn)(CFU)
收集培養(yǎng)液中誘導(dǎo)14d的細(xì)胞,用PBS清洗2遍,用40μm無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾除去大的細(xì)胞團(tuán)塊,將分化細(xì)胞按1×105細(xì)胞數(shù)/ml接種于半固體甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCult4435+中培養(yǎng),14d后在顯微鏡下觀察形成的細(xì)胞集落數(shù)目(CFC).
流式細(xì)胞術(shù)分析(FCM)
收集培養(yǎng)液中誘導(dǎo)14d的細(xì)胞,40μm無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾除去大的細(xì)胞團(tuán)塊,將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105細(xì)胞數(shù)/毫升,用PBS清洗3遍,分別加入小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人CD31-PE和小鼠抗人CD45-PE,同型對(duì)照為小鼠IgG1-APC和IgG1-PE,4℃避光孵育30min.碘化丙啶(PI)除去死細(xì)胞.上機(jī)分析分化細(xì)胞中各表面標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞的比例.
實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
分別提取人ES細(xì)胞以及誘導(dǎo)3、7和14d分化細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄后采用SYBRGreen法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)造血特異性基因的表達(dá).反應(yīng)總體系為10μl,反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min;然后95℃變性10s,退火30s,共40個(gè)循環(huán).各基因引物序列及退火溫度(Tm)見(jiàn)表1.采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珔X±SD)表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組之間進(jìn)行t檢驗(yàn),3組以上進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA).P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
結(jié)果
人ES細(xì)胞和分化細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察人ES細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)體系里呈巢狀集落樣生長(zhǎng),扁平狀,細(xì)胞之間界限清楚,細(xì)胞胞核大,胞質(zhì)少,核質(zhì)比高(圖1A).當(dāng)人ES細(xì)胞在matrigel、纖維粘連蛋白和IV型膠原蛋白這3種胞外基質(zhì)分別包被過(guò)的培養(yǎng)板里培養(yǎng),添加造血生長(zhǎng)因子開(kāi)始誘導(dǎo)分化,3組分化細(xì)胞鏡下形態(tài)相似.
隨著誘導(dǎo)天數(shù)增加,人ES細(xì)胞邊界逐漸消失,分化出的細(xì)胞向四周擴(kuò)散(圖1B),分化至10d細(xì)胞表面開(kāi)始出現(xiàn)許多囊腔結(jié)構(gòu)(圖1C),里面充滿著圓形細(xì)胞(圖1D),隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),這些圓形細(xì)胞有的會(huì)從囊腔結(jié)構(gòu)中跑出來(lái),漂浮在液體里,直至誘導(dǎo)14d時(shí)分化細(xì)胞的表面布滿了圓形細(xì)胞(圖1E,F).在整個(gè)分化過(guò)程中,在對(duì)照組未出現(xiàn)囊腔結(jié)構(gòu)以及圓形的細(xì)胞.
分化細(xì)胞的鑒定造血細(xì)胞集落形成培養(yǎng)2周后各實(shí)驗(yàn)組顯微鏡下均可觀察到紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系和混合細(xì)胞集落等各系細(xì)胞集落(CFC)的形成(圖2B),3組細(xì)胞數(shù)分別為(10±1.5)×105、(16±3.5)×105及(51±6.1)×105,CollagenIV包被組形成CFC數(shù)目明顯多于Matrigal和Fibronectin組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),其中形成CFU-E和CFU-G數(shù)目高于Matrigel以及Fibronectin組(P<0.05),形成CFU-GEMM數(shù)3組間未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)(圖2A).對(duì)照組未見(jiàn)有造血集落的形成.
特異性標(biāo)志物的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)分析誘導(dǎo)14d的分化細(xì)胞,結(jié)果顯示,Matrigel、Fibronectin以及CollagenIV組CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到(7.18±0.32)%、(9.59±0.4)%、(14.42±0.69)%,CollagenIV組高于前2組(P<0.05);3個(gè)組中CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到(0.04±0.005)%、(0.05±0.01)%、(1.49±0.08)%,CollagenIV組高于前2組(P<0.05);3個(gè)組中CD34和CD45雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例分別為(0.08±0.006)%、(1.16±0.12)%、(7.8±0.32)%,CollagenIV組顯著高于前2組(P<0.05);而3組中CD31陽(yáng)性以及CD34和CD31雙陽(yáng)的細(xì)胞數(shù)占有的比例無(wú)顯著的差異(圖3).在對(duì)照組細(xì)胞未檢測(cè)到CD34、CD31和CD45的陽(yáng)性表達(dá).
實(shí)時(shí)定量PCR分析造血細(xì)胞特異性基因的表達(dá)從圖4可以看出,隨著誘導(dǎo)分化啟動(dòng),ES細(xì)胞多能性標(biāo)志物Oct4和Nanog在各組細(xì)胞中的表達(dá)迅速下降至消失(圖4A,4B),而中胚層標(biāo)志物Brachyury、血液成血管細(xì)胞標(biāo)志物Flk1以及造血系統(tǒng)特異性基因CD34和轉(zhuǎn)錄因子SCL在人ES細(xì)胞中(即分化第0d)幾乎不表達(dá),分化第3d時(shí)Brachyury的表達(dá)量達(dá)到最高值,后逐漸下降直至消失,3組之間未見(jiàn)顯著差異(圖4C);3組Flk1的表達(dá)在分化第7d達(dá)高峰,3組Flk1相對(duì)表達(dá)量分別為25.74±3.65,27.83±2.41和63.03±7.99,且Matrigel和Fibronectin組顯著低于CollagenIV組(P<0.05),此后Flk1的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)(圖4D);隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加,CD34和SCL表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì),分化第14d時(shí)CollagenIV組的相對(duì)表達(dá)量分別為82.63±10.01和37.5±7.57,明顯高于Matrigel和Fibronectin組,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05)(圖4E,4F).在對(duì)照組細(xì)胞未檢測(cè)到特定基因的表達(dá).
討論
定向誘導(dǎo)分化是人ES細(xì)胞研究的重要內(nèi)容,將人ES細(xì)胞誘導(dǎo)為造血細(xì)胞常采用傳統(tǒng)的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)和擬胚體誘導(dǎo)法,但是這些方法繁瑣,重復(fù)性查,獲得的細(xì)胞數(shù)量有限,而且分化體系中添加了成分不確定的胎牛血清,致使難以研究分化機(jī)制,也限制了其臨床應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)采用人ES細(xì)胞直接貼壁分化的誘導(dǎo)策略既沒(méi)有擬胚體復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),也不存在基質(zhì)細(xì)胞或胎牛血清的動(dòng)物源性污染,縮短與臨床應(yīng)用的距離,同樣可以有效地產(chǎn)生造血祖細(xì)胞,這一方法成功的關(guān)鍵是胞外基質(zhì)的選擇.研究表明,細(xì)胞微環(huán)境對(duì)維持人ES細(xì)胞自我更新以及細(xì)胞命運(yùn)的決定極其重要,其中胞外基質(zhì)是重要組成部分[5].胞外基質(zhì)不但為細(xì)胞提供生長(zhǎng)分化的支架,也提供維持細(xì)胞存活、遷移和命運(yùn)決定的調(diào)控因子.胞外基質(zhì)通常是大分子糖蛋白,包括基質(zhì)膠(matrigel)、纖維黏連蛋白(fibrobectin)、膠原蛋白(collagen)、層黏連蛋白(laminnin)和蛋白多糖等.
本實(shí)驗(yàn)采用人ES細(xì)胞接種至基質(zhì)膠、纖維粘連蛋白和IV型膠原蛋白這3種胞外基質(zhì)包被過(guò)的培養(yǎng)板上直接貼壁分化的誘導(dǎo)方法,產(chǎn)生的CD34+造血祖細(xì)胞最高達(dá)到15.06%,表達(dá)CD45的造血祖細(xì)胞可達(dá)7.8%,與傳統(tǒng)的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)和擬胚體法的分化效率相似,但是這一誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單易操作,而且無(wú)血清、無(wú)基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)體系更接近于未來(lái)的臨床應(yīng)用.
造血過(guò)程中多種生長(zhǎng)因子發(fā)揮著重要作用,外源性添加生長(zhǎng)因子在一定程度上能模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境,促進(jìn)造血發(fā)生.國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化過(guò)程中需全程添加細(xì)胞因子,包括BMP4、bFGF、VEGF、SCF、Flt3L、IL-3和IL-6等[6,7].既往研究表明,人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化過(guò)程中,只有BMP4能誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)中胚層造血細(xì)胞發(fā)育必需的原條樣細(xì)胞群,啟動(dòng)造血中胚層基因表達(dá)和少量造血祖細(xì)胞的產(chǎn)生;BMP4、VEGF、SCF和bFGF共同作用則誘導(dǎo)出高效的造血細(xì)胞[8].近年有研究證實(shí),在人ES細(xì)胞向造血系分化過(guò)程中序貫加入不同的細(xì)胞因子更能有效地產(chǎn)生造血祖細(xì)胞[9].本研究整個(gè)分化過(guò)程中細(xì)胞因子分兩步添加,第1步加入BMP4、VEGF和bFGF,第2步加入SCF、Flt3L、IL-3和IL-6,誘導(dǎo)14d后對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定,造血集落形成、流式細(xì)胞分析術(shù)以及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果均證實(shí)人ES細(xì)胞有效地分化為造血祖細(xì)胞.本研究中外源性造血生長(zhǎng)因子的添加誘導(dǎo)人ES細(xì)胞開(kāi)始分化,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)組分化細(xì)胞中干細(xì)胞多能性標(biāo)志物Oct4和Nanog表達(dá)呈急劇下降的趨勢(shì),盡管分化早期誘導(dǎo)效率很低,但是中胚層標(biāo)志物Brachyury、血液成血管細(xì)胞標(biāo)志物Flk1以及造血系統(tǒng)特異性轉(zhuǎn)錄因子SCL和基因CD34的相對(duì)表達(dá)量對(duì)于內(nèi)參基因β-actin仍呈成倍增長(zhǎng),這是ES細(xì)胞一旦啟動(dòng)分化,未分化狀態(tài)和多能性特性迅速喪失的結(jié)果[10].
本研究還比較了基質(zhì)膠、纖維黏連蛋白和IV型膠原蛋白對(duì)產(chǎn)生造血細(xì)胞的不同作用.基質(zhì)膠多用于人ES細(xì)胞無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的培養(yǎng)皿處理[11],也可用于人ES細(xì)胞的貼壁誘導(dǎo)向造血細(xì)胞的分化[12].
纖維黏連蛋白和IV型膠原蛋白支持小鼠ES細(xì)胞來(lái)源的表達(dá)Flk1的祖細(xì)胞向造血細(xì)胞分化[13].纖維黏連蛋白能促進(jìn)中胚層分化,誘導(dǎo)人ES細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化[14].IV型膠原蛋白也能促進(jìn)中胚層發(fā)育,誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向內(nèi)皮、心血管和造血系的分化[15],但具體的分化效率并未報(bào)道.本研究中造血集落形成實(shí)驗(yàn)顯示這3種胞外基質(zhì)上培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞均具有造血干/組細(xì)胞的造血集落形成能力,而且IV型膠原蛋白上形成的造血CFC數(shù)目明顯高于其它兩組.流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IV型膠原蛋白組CD34+和CD34+CD45+細(xì)胞數(shù)量顯著大于基質(zhì)膠組和纖維黏連蛋白組;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示IV型膠原蛋白組造血特異性基因CD34和SCL的相對(duì)表達(dá)量最高.由此證實(shí),采用人ES細(xì)胞直接貼壁的誘導(dǎo)方法選擇IV型膠原蛋白更利于向造血細(xì)胞分化.
本研究建立了一種人胚胎干細(xì)胞在胞外基質(zhì)上直接貼壁培養(yǎng)、有效地分化為造血祖細(xì)胞的新誘導(dǎo)方法,為造血祖細(xì)胞的大量產(chǎn)生以及進(jìn)一步分化產(chǎn)生其它功能性血細(xì)胞提供足夠的細(xì)胞來(lái)源,同時(shí)發(fā)現(xiàn)IV型膠原蛋白利于人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞誘導(dǎo),為胚胎干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化提供技術(shù)平臺(tái).
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