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談富集光合細(xì)菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究
論文關(guān)鍵詞:光合細(xì)菌 培養(yǎng)基 正交實(shí)驗(yàn)
論文摘要:采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)一種富集光合細(xì)菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果表明:酵母膏和NaHCO3在培養(yǎng)基中的濃度對(duì)富集紅螺菌科的光合細(xì)菌有顯著的影響。若以達(dá)到相同生長(zhǎng)量(OD660值)做指標(biāo),應(yīng)用優(yōu)選出來(lái)的培養(yǎng)基進(jìn)行富集比原培養(yǎng)基要提前5~6 d。
光合細(xì)菌(PSB)是一大類(lèi)能進(jìn)行光合作用的原核生物的總稱。研究應(yīng)用的實(shí)踐表明,光合細(xì)菌中的紅螺菌科能利用多種硫化物和有機(jī)物作為其光合作用的供氫體和有機(jī)碳源,在高濃度的有機(jī)廢水處理與資源化、水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控與促進(jìn)健康生長(zhǎng)、在中作為高效活性菌肥等方面,發(fā)揮著十分有益的和令人矚目的作用[1]。光合細(xì)菌的推廣和應(yīng)用,需要合適的培養(yǎng)基質(zhì),但目前經(jīng)典的用于富集紅螺菌科光合細(xì)菌的培養(yǎng)基(小林達(dá)治1977)[2]平均富集的時(shí)間為2~8周,且存在培養(yǎng)基成分種類(lèi)多,較高的缺點(diǎn)。為此,筆者在教學(xué)實(shí)踐中,對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用型優(yōu)化設(shè)計(jì),旨在為高活性光合細(xì)菌的推廣應(yīng)用提供一定的幫助。
1 和方法
1.1 樣品和菌種來(lái)源
光合細(xì)菌樣品來(lái)自湛江港岸潮間帶表層沉積物、湛江湖光巖附近奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和鴨塘的污水和底泥中。共分離出3種紅螺菌科菌株:沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、紅螺菌(Rhodospirillumsp.),沼澤紅假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌群,故選沼澤紅假單胞菌為本試驗(yàn)菌種。
1.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基采用《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[2]中配方:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.1 g(5%水溶液,過(guò)濾除菌取2 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5 g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g,(取0.2 g)生長(zhǎng)因子1ml,微量元素溶液1ml,蒸餾水97 ml,pH 7.0。
1.3 方法
1.3.1 富集培養(yǎng)基的初步優(yōu)選
1.3.1.1 NaHCO3利用試驗(yàn) 在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn):適當(dāng)?shù)奶岣逳aHCO3濃度,可縮短富集的時(shí)間。為探索其中量的關(guān)系,筆者做如下試驗(yàn)設(shè)計(jì):取滅菌的富集培養(yǎng)基以250 ml/瓶裝入醫(yī)用點(diǎn)滴瓶中,上鋪一層無(wú)菌液體石蠟, NaHCO3過(guò)濾除菌后依比例0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%加入。每種培養(yǎng)條件做2個(gè)重復(fù)。沼澤紅假單胞菌(7.4×108個(gè)/ml)接種量為2%, 30℃,3000 lx光照強(qiáng)度下連續(xù)培養(yǎng)6d,每天在660 nm處測(cè)定其光密度OD值,以不加碳酸氫鈉的培養(yǎng)基接種做對(duì)照。
1.3.1.2 酵母膏對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 紅螺菌科光合細(xì)菌生長(zhǎng)需要硫胺素、生物素等生長(zhǎng)因子。為此,在培養(yǎng)基中添加一定量的酵母膏能促進(jìn)光合細(xì)菌生長(zhǎng)。將富集培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子和微量元素溶液分別用蒸餾水替代,酵母膏分別以0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%,0.25%添加。同1.3.1.1接種培養(yǎng)3 d后,測(cè)定其OD660值。
1.3.2 改良培養(yǎng)基組成成分的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]為研究NaHCO3和酵母膏濃度對(duì)富集培養(yǎng)基的綜合效應(yīng)及和作為氮源的NH4Cl有無(wú)交互作用,采用L8(27)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(如表1),富集培養(yǎng)基100 ml,去除其中的生長(zhǎng)因子和微量元素溶液
1.3.3 優(yōu)化培養(yǎng)基的確立分別從湛江港岸潮間帶表層、湛江湖光巖附近奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)及鴨塘取淤泥、污水若干。50 g淤泥及100 ml污水裝入500 ml具塞磨砂廣口瓶,每個(gè)樣品4瓶。2瓶添加200 ml改良的富集培養(yǎng)基,另外2瓶添加原富集培養(yǎng)基。攪拌均勻后,加入滅菌的液體石蠟以隔絕空氣。25~35℃下用5000~10000 lx(距40 W白熾燈15~50 cm)的光照強(qiáng)度連續(xù)培養(yǎng)18 d,觀察記錄兩種富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)過(guò)程中光密度(OD660)變化。
2 結(jié)果與分析
2.1 富集培養(yǎng)基的初步優(yōu)選結(jié)果
2.1.1 NaHCO3利用試驗(yàn)
隨著NaHCO3濃度的增加,菌株到達(dá)穩(wěn)定生長(zhǎng)期的時(shí)間縮短。NaHCO3濃度<2%時(shí),菌體生長(zhǎng)濃度隨NaHCO3濃度增加而增大。2%時(shí),光密度值最大。說(shuō)明此時(shí)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)條件最為適合(見(jiàn)圖1)。
2.1.2 酵母膏利用試驗(yàn)
隨著酵母膏濃度的增加,光合細(xì)菌菌體生長(zhǎng)濃度逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母膏的濃度為0.1%時(shí),其菌體生長(zhǎng)濃度和添加0.15%酵母膏時(shí)的生長(zhǎng)濃度無(wú)顯著性差異,從角度考慮,選擇0.1%酵母膏較好(見(jiàn)圖2)。
2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從方差分析表結(jié)果可以看出:A因素(NaHCO3)和C因素(酵母膏)的主效應(yīng)是主要影響因素。酵母膏的含量對(duì)富集試驗(yàn)結(jié)果的影響要更大一些。NaHCO3作為添加的碳源,和作為氮源的酵母膏、NH4Cl之間的交互作用都很小。培養(yǎng)基合適的C/N是微生物進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖的前提,從極差分析很容易選出最優(yōu)水平是A2B1C2,即改良培養(yǎng)基的NaHCO3含量為2.0 g,酵母膏含量為1.0 g,其他條件不變。從以上分析得出優(yōu)選培養(yǎng)基:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.2 g(5%水溶液,過(guò)濾除菌取4 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g(取0.2 g),酵母膏0.1 g,蒸餾水96 ml,pH 7.0。
2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證結(jié)果
兩種富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖3~圖5。由圖可見(jiàn):海灘污水樣品中光合細(xì)菌使用改良富集培養(yǎng)基12 d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.321),而原富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.329)在第18 d出現(xiàn);鴨塘污水中光合細(xì)菌使用改良培養(yǎng)基富集11 d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.326),而原富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.329)則在第16 d出現(xiàn);奶牛場(chǎng)污水中光合細(xì)菌使用改良培養(yǎng)基富集11d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.339),而原富集培養(yǎng)基培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.339)則在第16 d出現(xiàn)。使用改良培養(yǎng)基從3個(gè)地點(diǎn)(海灘、奶牛場(chǎng)、鴨塘)樣品中富集光合細(xì)菌比原培養(yǎng)基提前5~6 d。
3 討論
NaHCO3在富集光合細(xì)菌過(guò)程中有很大的作用。①用于調(diào)整培養(yǎng)液的pH。對(duì)于異養(yǎng)型光合細(xì)菌,一般使用5%的NaHCO3把pH調(diào)節(jié)到7.0~8.0。②NaHCO3產(chǎn)生的CO2在細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)代謝中具有重要作用。首先,CO2能與有機(jī)酸結(jié)合,生成多羧基酸,在三羧酸循環(huán)中起重要作用[4]。其次,CO2能促進(jìn)莢膜細(xì)菌莢膜的形成,推測(cè)其可促進(jìn)莢膜紅假單胞菌的增殖[5]。③富集培養(yǎng)相對(duì)于分離培養(yǎng)所用的時(shí)間較長(zhǎng),加大作為碳源的碳酸氫鈉的用量能延續(xù)增長(zhǎng)光合細(xì)菌的數(shù)量,這點(diǎn)對(duì)于第一次富集培養(yǎng)尤為重要;但是NaHCO3不能加得過(guò)多,這是因?yàn)镹aHCO3會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液堿化而不利于光合細(xì)菌的生長(zhǎng);NaHCO3是富集螺旋藻等其他藻類(lèi)的主要營(yíng)養(yǎng)成分。加量過(guò)多,促進(jìn)藻類(lèi)繁殖,光合細(xì)菌富集會(huì)受到影響。
酵母膏對(duì)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)有明顯的刺激作用。這主要是由于酵母膏的營(yíng)養(yǎng)豐富,含有光合細(xì)菌所需要的各種生長(zhǎng)因子。酵母膏濃度在0.25%以內(nèi)對(duì)菌體繁殖速度有很大的影響,但濃度過(guò)高,容易染菌,不利于分離[6]。
光合細(xì)菌是國(guó)內(nèi)外致力于開(kāi)發(fā)的微生物資源,在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有去除NH4+和NO2-,改善水質(zhì),提高魚(yú)飼料營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)魚(yú)、蝦生長(zhǎng)發(fā)育的功效。光合細(xì)菌的推廣應(yīng)用需要合適的培養(yǎng)基質(zhì),本試驗(yàn)根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量來(lái)看,改良培養(yǎng)基效果良好。但能否是最佳方案,還需進(jìn)一步研究。
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