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腺病毒介導凋亡素基因?qū)θ四懝馨┘毎蛲龅难芯?/p> 畢業(yè)論文
【摘要】 目的 探討凋亡素基因轉(zhuǎn)染對人膽管癌細胞凋亡的影響，為膽管癌的治療探索新方法。方法 采用含凋亡素基因的重組腺病毒感染膽管癌細胞株QBC939，在確定其感染復數(shù)后通過光鏡、熒光觀察其凋亡情況，同時通過TUNEL染色統(tǒng)計凋亡率。結(jié)果 膽管癌細胞株QBC939的重組腺病毒的感染復數(shù)為65，在感染后第3天凋亡素基因能引發(fā)膽管癌細胞株QBC939的凋亡，并且隨著時間的推移其作用越明顯，在第7天凋亡率達到61.9%。結(jié)論 凋亡素能明顯引發(fā)人膽管癌細胞的凋亡，在膽管癌的治療上具有較大潛力。
【關(guān)鍵詞】 凋亡素基因； 腺病毒載體； 基因治療； 膽管癌
【Abstract】 Objective To study the effect of adenovirus?mediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells and explore new ways to manage bile duct carcinoma. Methods The human bile duct carcinoma cell line QBC939 was transfected by recombinant adenovirus carrying apoptin gene. After the multiplicity of infection was determined successfully, the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 was observed by light microscopy and fluorescence microscopy and the rate of apoptosis detected by TUNEL stain. Results The value of multiplicity of infection of human bile duct carcinoma cell line QBC939 transfected by recombinant adenovirus was 65. Apoptin gene started to induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 on the 3rd day and the induction function of apoptin gene increased with time. The apoptosis index of human bile duct carcinoma cell line QBC939 reached 61.9% on the 7th day. Conclusion The apoptin gene can obviously induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939, and may be a powerful tool to treat cholangiocarcinoma.
【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy; Cholangiocarcinoma
凋亡素， 又稱Apoptin(apoptosis induction)，是來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白質(zhì)。它能引發(fā)1些腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞的凋亡，而對正常細胞無此作用。這提示凋亡素在腫瘤的治療上具有較大潛力［1］。目前膽管癌的治療效果難盡人意，迫切需要探索新的治療方法。本實驗利用腺病毒為載體轉(zhuǎn)染人膽管癌細胞株，以觀察凋亡素基因?qū)θ四懝馨┘毎蛲龅挠绊懗潭�，以期探索治療膽管癌的新方法�?/P>
1 材料與方法
1.1 材料
我們已成功構(gòu)建含凋亡素基因的重組腺病毒載體［2］。不含目的基因的腺病毒載體由第3軍醫(yī)大學西南醫(yī)院燒傷研究所賀偉峰提供；人膽管癌細胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin 3型細胞離心機購自美國Shandon公司；TUNEL試劑購自德國Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 QBC939細胞的重組腺病毒感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的測定：在6孔板上傳5×105/孔培養(yǎng)QBC939細胞，細胞過夜生長。將病毒量為6.56×109 pfu/ml的病毒稀釋5倍后分別取2、5、10、25、50 μl(相應的病毒量為：2.61×106、6.56×106、1.31×107、3.28×107、6.56×107)加入6孔板中的5孔，第6孔作為對照。同時加培養(yǎng)液500 μl，5% CO2、37 ℃條件下孵育。間隔30 min輕輕搖晃數(shù)次，使之與細胞充分接觸，孵育3 h后加入培養(yǎng)液1500 μl，72 h后用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光情況。選取接近100%的細胞發(fā)熒光的孔所對應的病毒量來計算MOI值。公式為MOI=病毒數(shù)/細胞數(shù)。這樣可確定最佳感染復數(shù)。
1.2.2 重組腺病毒對膽管癌細胞株QBC939的感染： 根據(jù)上1步探索出的最適MOI來決定病毒的量， 每日通過熒光顯微鏡觀察并記錄QBC939細胞的情況。在1、3、5、7 d后分別收集細胞爬片， 對于脫落的細胞采用制成細胞甩片來觀察。實驗共分3組， 重組腺病毒組、 空病毒組和空白組(培養(yǎng)液組)。甩片的制作為： 100×g離心10 min， 用PBS洗滌細胞1次， 然后用4 ml PBS重溶細胞， 記錄收集的細胞數(shù)目約為4000個。將1/10的液體加入與甩片裝置安裝好的玻片上， 1000×g離心10 min后制成細胞甩片。
1.2.3 人膽管癌細胞爬片及甩片的TUNEL染色：人膽管癌細胞爬片和甩片的TUNEL染色嚴格按照試劑盒說明書進行。同時計算凋亡率。公式為：凋亡率(Apoptosis Index,AI)=陽性細胞數(shù)/500細胞總數(shù)×100%。
1.3 統(tǒng)計學分析
SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各組間分別進行獨立樣本t檢驗檢測均值， 結(jié)果用±s表示。
2 結(jié)果
2.1 膽管癌細胞株QBC939的最適腺病毒MOI值
我們用不同腺病毒濃度對應MOI分別為5.3、13.1、26.2、65和131。隨著MOI的提高，膽管癌細胞株的感染率也相應提高，但同時也出現(xiàn)了細胞脫壁現(xiàn)象的增加。這提示腺病毒的毒性作用也隨之增大。所以最適MOI應該是細胞的感染率較高，同時細胞脫落和其對應的毒性作用相對較低。因此我們確定MOI為65是含凋亡素基因腺病毒的最適感染復數(shù)值(圖1)。同時MOI為65所對應的空病毒感染也提示感染率很高，細胞脫落現(xiàn)象較少。所以我們也將此值作為空病毒的最適感染復數(shù)值。
A：重組腺病毒組光鏡圖； B：重組腺病毒組熒光圖； C：空病毒組光鏡圖； D：空病毒組熒光圖
圖1 膽管癌細胞株QBC939的最適腺病毒為65的光鏡和熒光觀察結(jié)果 (×400)
2.2 重組腺病毒感染QBC939細胞后的變化
我們從膽管癌細胞株QBC939的光鏡和熒光照片觀察到如下現(xiàn)象：(1)光鏡下，細胞在感染含凋亡素基因的病毒后第1天可觀察到有少量細胞脫落，同時細胞開始出現(xiàn)感染病毒后的變化：細胞略腫脹，有少量細胞融合，但細胞排列結(jié)構(gòu)沒有變化，隨著感染時間延長，細胞脫落數(shù)增加，細胞開始變小，細胞核和細胞質(zhì)縮小，細胞巢狀生長的密度明顯降低。少數(shù)細胞可明顯觀察到核仁沿核膜排列呈新月狀。在感染后第7天可觀察到細胞核變成兩個核，細胞變小，有些細胞已經(jīng)失去正常結(jié)構(gòu)成為碎片樣。空病毒組和空白對照組以上變化不明顯，反而是細胞密度增加，細胞脫落數(shù)目較含凋亡素基因的腺病毒明顯減少。(2)熒光下，第4天觀察到大部分細胞發(fā)出熒光。 這說明在第4天腺病毒的感染才達到高峰。這時，含凋亡素基因腺病毒感染的細胞脫落量較空病毒組和空白對照組大，并且脫落的細胞也呈現(xiàn)熒光，有些細胞輪廓明顯變小，熒光強度明顯增加，也有1些細胞結(jié)構(gòu)消失，變?yōu)樯畹臒晒馑槠�，而空病毒組以上變化不明顯(圖2)。
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