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不同壓力二氧化碳?xì)飧箤ξ赴┘?xì)胞增殖運(yùn)動的影響
畢業(yè)論文作者：郝迎學(xué) 鐘華 曾冬竹 石彥 饒蕓 周立新 余佩武
【摘要】 目的 通過體外模擬氣腹環(huán)境，觀察不同壓力CO2對胃癌細(xì)胞MKN?45增殖、運(yùn)動的影響。方法 將MKN?45細(xì)胞置于充滿CO2的密閉培養(yǎng)箱中，按CO2壓力不同分為對照組、0、5、10和15 mm Hg組(1 mm Hg=0.133 kPa)，作用時間均為4 h。用血?dú)夥治鰞x檢測培養(yǎng)液pH值；MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期變化；Transwell法觀察細(xì)胞遷移運(yùn)動變化。結(jié)果 0、5、10和15 mm Hg組細(xì)胞培養(yǎng)液在0 h呈酸性。MTT法檢測細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)0、5、10 mm Hg組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，15 mm Hg組與對照組比較吸光度(OD)值在1～3 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.625,-0.537,0.137,P＞0.05)，在4～7 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.622,13.376,18.839,7.595,P＜0.01)。0、5、10 mm Hg組細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞穿過濾膜的數(shù)量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.134,-0.538,-0.829;t=0.330,0.794,0.508,P>0.05)，15 mm Hg組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.225,8.775,P<0.01)。結(jié)論 在15 mm Hg壓力下，CO2對MKN?45細(xì)胞增殖、運(yùn)動起抑制作用。
【關(guān)鍵詞】 氣腹； 胃腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞運(yùn)動
【Abstract】 Objective To investigate the effects of CO2 pneumoperitoneum with different pressures on the proliferation and motility of cultured human gastric cancer cell line MKN?45 in vitro. Methods According to different CO2 pressures, gastric cancer cell line MKN?45 was divided into 0 mm Hg group, 5 mm Hg group, 10 mm Hg group, 15 mm Hg group and control group. The pH value of cell culture medium, proliferation, changes of cycle and migration of gastric cancer cells was detected by blood gas analyzer, MTT assay, flow cytometry and Transwell method, respectively 4 hours later after CO2 insufflation. Results The pH values of culture medium in 0 mm Hg, 5 mm Hg , 10 mm Hg and 15 mm Hg group were lower than 7 at hour 0. No statistical difference of gastric cancer cell proliferation was seen between 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg group and control group (P>0.05). The difference of optical density had no statistical difference between 15 mm Hg group and control group from day 1 to day 3 (t=0.625, -0.537, 0.137, P>0.05), but had statistical difference from day 4 to day 7 (t=26.622, 13.376, 18.839, 7.595,P<0.01). In regard of cell proliferation and number of cells migrated through the filter membrane, there was no statistical difference between groups 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg and control group (t=1.134, -0.538, -0.829; t=0.330, 0.794, 0.508, P>0.05), but significant statistical difference between 15 mm Hg group and control group (t=11.225, 8.775, P<0.01). Conclusions CO2 pneumoperitoneum has inhibitory effect on proliferation and motility of gastric cancer cell line MKN?45 under 15 mm Hg pressure.
【Key words】 Pneumoperitoneum; Stomach neoplasm; Cell proliferation; Cell cycle; Cell motility
腹腔鏡胃癌根治術(shù)治療早期胃癌已取得滿意的近、 遠(yuǎn)期效果［1］。但對腫瘤已侵及漿膜的進(jìn)展期胃癌是否可施行腹腔鏡胃癌根治術(shù)仍存在不同看法。主要原因是該手術(shù)是否會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的播散轉(zhuǎn)移尚有爭論，特別是作為常用氣腹介質(zhì)CO2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目前仍不10分清楚。本研究應(yīng)用CO2體外模擬氣腹環(huán)境，觀察其對胃癌細(xì)胞增殖運(yùn)動的影響。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組
胃癌MKN?45細(xì)胞(購自第4軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化研究所)常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中。實驗分為5組，對照組：培養(yǎng)板直接放入37 ℃、5% CO2孵箱中；0 mm Hg組：將培養(yǎng)板置于充滿CO2的壓力箱中， 調(diào)節(jié)壓力為0 mm Hg； 5、10、15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)組則將培養(yǎng)板分別置于壓力為5、10、15 mm Hg的壓力箱中。5組孵育時間均為4 h。
1.2 體外模擬CO2氣腹環(huán)境的建立
將60 cm×40 cm×30 cm的密閉保鮮箱改造成密閉培養(yǎng)箱，側(cè)壁的1面靠近底部開有1個進(jìn)氣孔，另1面靠近頂部處開有1個出氣孔；進(jìn)氣孔通過1根橡膠軟管與氣腹機(jī)出氣口相連，氣腹機(jī)進(jìn)氣口與高純度的CO2鋼瓶減壓閥相連。建立CO2氣腹時通入高純度CO2(流量為5～8 L/min)持續(xù)1 h。1 h 后如氣體分壓儀顯示壓力箱內(nèi)的CO2濃度＞99%，即說明壓力箱內(nèi)已達(dá)到純CO2的條件。此時可關(guān)閉出氣孔，調(diào)整氣體流量至需要的壓力并保持。
1.3 血?dú)夥治鰞x測定培養(yǎng)液pH值
將處于對數(shù)生長期的MKN?45細(xì)胞消化、重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個/ml。分別取1 ml加入24孔培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞2.0×105個。置入密閉培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，分別于排氣后0、2、4、6、10 h取各組培養(yǎng)液各1 ml，用血?dú)夥治鰞x測pH值，每組4孔，取均值。
1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性
調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104個/ml，分別取200 μl加入96孔培養(yǎng)板中。分別于排氣后第1～7天檢測細(xì)胞增殖活性，于檢測前4 h在96孔培養(yǎng)板中分別加入MTT溶液20 μl，4 h后吸出培養(yǎng)液和MTT溶液，再分別加入150 μl2甲基亞砜，混勻后于酶標(biāo)儀490 nm測吸光度(OD)值，每天測8個復(fù)孔，取均值。
1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化
用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期前，振蕩器使細(xì)胞分散并將細(xì)胞滴入75%乙醇，邊滴邊振蕩，放入4 ℃冰箱固定12 h，加入碘化丙啶，置500目尼龍網(wǎng)過濾，再用流式細(xì)胞儀分析。
1.6 Transwell法檢測細(xì)胞遷移率
細(xì)胞消化、重懸、分組同血?dú)夥治觥Ｓ貌缓宓呐囵B(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個/ml，取400 μl含細(xì)胞的無血清培養(yǎng)液放入Boyden小室中，將小室置入預(yù)先加入600 μl含10%血清培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)板置入壓力培養(yǎng)箱中，4 h后取出培養(yǎng)板再常規(guī)培養(yǎng)6 h，甲醇固定，蘇木精染色，400倍顯微鏡隨機(jī)選取5個視野計數(shù)遷移至下層小室細(xì)胞數(shù)，取均值。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
計量資料以±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗及單因素方差分析F檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 培養(yǎng)液pH值變化
0、5、10和15 mm Hg組與對照組比較，處理后0 h培養(yǎng)液pH值明顯降低，壓力越大，降低越明顯；連續(xù)檢測處理后第2、4、6、8、10小時，發(fā)現(xiàn)在移至正常培養(yǎng)環(huán)境后，各組pH值很快恢復(fù)正常，其中15 mm Hg組恢復(fù)最慢，為處理后6 h恢復(fù)正常(圖1)。
圖1 不同壓力下各組細(xì)胞培養(yǎng)液pH值隨時間的變化
2.2 細(xì)胞增殖活性變化
0、5、10 mm Hg組與對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；15 mm Hg組與對照組OD值比較在1～3 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.625，-0.537，0.137,P＞0.05)，在4～7 d下降非常顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.622，13.376，18.839， 7.595，P＜0.01)。
2.3 細(xì)胞周期變化
根據(jù)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果計算各組細(xì)胞增殖指數(shù)(profile index，PI)，計算公式為PI=(S+G2/G1+S+G2+M)×100%。結(jié)果0、 5、 10 mm Hg組與對照組PI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=1.134， -0.538，-0.829，P＞0.05)；15 mm Hg組PI明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.225，P＜0.05)。
2.4 細(xì)胞遷移率變化
0、5、10 mm Hg組細(xì)胞處理后6 h穿過濾膜的數(shù)量分別為123±18.28、133±10.31、126±6.50，與對照組的122±21.93比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.330，0.794，0.508，P＞0.05)；15 mm Hg組為22±12.87， 較對照組明顯減少(t=8.775，P＜0.01)(圖2，3)。
3 討論
雖然腹腔鏡胃癌手術(shù)時間較傳統(tǒng)開腹手術(shù)長，但因有術(shù)后疼痛輕、胃腸功能恢復(fù)快、住院時間短、腹壁瘢痕小及對機(jī)體免疫功能影響小等優(yōu)點(diǎn)，顯示了腹腔鏡手術(shù)的優(yōu)越性［2-3］。我科自2004年3月開展腹腔鏡胃癌根治術(shù)以來，已行腹腔鏡胃癌根治術(shù)302例，其中進(jìn)展期胃癌236例，近期效果良好。在腫瘤切除范圍、淋巴結(jié)清掃數(shù)目等方面與開腹手術(shù)無明顯差別［4］。
但是，目前進(jìn)展期胃癌行腹腔鏡胃癌根治術(shù)發(fā)展仍然緩慢，主要原因是對腹腔鏡手術(shù)是否會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)播散及戳孔種植轉(zhuǎn)移存在爭議。目前，有關(guān)CO2氣腹對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的報道很不1致。Takiguchi等［5］報道CO2氣腹會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，包括結(jié)直腸癌、腺癌和其他惡性腫瘤。Leng等［6］報道體外模擬CO2氣腹環(huán)境，培養(yǎng)的卵巢癌HO8910細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞會隨著壓力的升高、時間的延長，其凋亡的比例增加。徐春陽等［7］報道在CO2氣腹條件下，早期抑制子宮內(nèi)膜癌HTB?113細(xì)胞的生長，而在處理后的5～12 d促進(jìn)癌細(xì)胞的生長。Gutt等［8］報道在充氣后1～4 d胰腺癌細(xì)胞DAN?G和結(jié)腸癌細(xì)胞CX?2生長明顯受到抑制，而在第5～15天兩種癌細(xì)胞增殖明顯加快，DAN?G細(xì)胞的增殖獨(dú)立于氣腹壓力，而CX?2細(xì)胞的增殖則依賴于CO2的壓力。我們的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞MKN?45在低CO2壓力條件下，其增殖活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在15 mm Hg條件下其增殖活性明顯低于對照組。我們對細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值檢測中發(fā)現(xiàn)，15 mm Hg組細(xì)胞培養(yǎng)液pH值變化較大，恢復(fù)正常需要約6 h。其機(jī)制可能為在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)下，缺氧誘導(dǎo)因子1?α磷酸化與HIF?1β分離，和P53結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［9］。
我們在實驗中還發(fā)現(xiàn)，在0、5、10 mm Hg組MKN?45細(xì)胞遷移通過Boyden小室8 μm濾膜的數(shù)目較對照組稍多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而15 mm Hg組MKN?45細(xì)胞遷移率明顯少于對照組(P＜0.01)。我們分析這可能與15 mm Hg組細(xì)胞大部分發(fā)生凋亡有關(guān)，而較高壓力是否會影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力還需要進(jìn)1步研究。
我們的研究結(jié)果顯示，在臨床常用的氣腹壓力(≤10 mm Hg)下CO2不會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和遷移，而在較高氣腹壓力(15 mm Hg)下CO2抑制胃癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動。
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