三七總苷對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的影響探析

　　【摘要】

　　［目的］研究37總苷（PNS）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放1氧化氮（NO）的影響。［方法］大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑誘發(fā)大鼠AA模型，采用硝酸還原酶法檢測(cè)AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放的NO。［結(jié)果］體外給藥PNS 0.4mg/ml，作用4h時(shí)，增加AA大鼠NO釋放（P<0.05）；體外給藥PNS 0.2mg/ml 及0.4mg/ml，作用8h時(shí)，抑制AA大鼠NO釋放 （P<0.05，P<0.01）；體外給藥PNS 0.8mg/ml及PNS 1.6mg/ml，作用24h時(shí)，增加AA大鼠NO釋放 （P<0.01，P<0.05）。［結(jié)論］PNS體外給藥隨濃度及作用的時(shí)間變化，對(duì)AA大鼠釋放NO有雙向調(diào)節(jié)作用，PNS抑制 AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO可能在AA治療中起1定的作用。

　　【關(guān)鍵詞】 37總苷 佐劑性關(guān)節(jié)炎 1氧化氮

　　Abstract(冒號(hào))：［Objective］To investigate the influence of panax notoginseng saponins （PNS）on production of Nitric Oxide（NO） by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis（AA）.［Methods］Complete Freunds adjuvant was used to induce AA in rats.Production of NO by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis was determined by nitrate reductase.［Results］PNS 0.4mg/ml increased NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats in vitro after four hours（P<0.05）；PNS 0.2mg/ml and 0.4mg/ml reduced NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after eight hours respectively（P<0.05，P<0.01）；PNS 0.8mg/ml and 1.6mg/ml increased NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after twenty?four hours respectively（P<0.01，P<0.05）.［Conclusion］ PNS has bidirection influence on production of NO by peritoneal macrophages of AA rats with change of concentration and times.PNS reduced NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats，which may be effective on treating AA.

　　Key words(冒號(hào))：panax notoginseng saponins；adjuvant arthritis；Nitric Oxide

　　37Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen為5加科人參屬植物的根，具滋補(bǔ)強(qiáng)壯、止血、活血化瘀、消腫止痛的功效。37總苷（panax notoginseng saponins，PNS）是37的主要活性成分，研究顯示，PNS有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用［1?2］。在臨床實(shí)踐中，我們應(yīng)用PNS治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，在短期內(nèi)控制RA病情急性活動(dòng)，減輕軟組織腫脹，改善關(guān)節(jié)功能等療效。為進(jìn)1步探討PNS抗炎作用的可能機(jī)制，本文進(jìn)行了PNS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO影響的研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制作及給藥方法 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性喂養(yǎng)2周后，參照文獻(xiàn)［3］以卡介苗與弗氏不完全佐劑充分乳化混勻配成10mg／ml的乳劑，于每鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.05ml致炎。2周后分離腹腔巨噬細(xì)胞。

　　1.2.2 DMEM培養(yǎng)液配制

　　1.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng) 大鼠頸動(dòng)脈放血，腹腔注入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）（PH7.2）10ml灌洗腹腔，輕揉腹部后取腹腔液。1200r/min離心10min，吸棄上清，用DMEM培養(yǎng)液混懸沉淀，調(diào)至5×108/L，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁1h。吸棄培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗3次，以除去非粘附細(xì)胞，獲單層腹腔巨噬細(xì)胞。每孔加入含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液及LPS（終濃度為10μg/ml），并按如下6個(gè)實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理，每組4孔，地塞sai米松（DM）作為陽性對(duì)照組。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組依次是(冒號(hào))：AA組、AA+PNS 0.2mg/ml組、AA+PNS 0.4mg/ml組、AA+PNS 0.8mg/ml組、AA+PNS 1.6mg/ml組、AA+DM 10?7mmol/L組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4、8、24h，每次取0.2 ml上清液，-20℃保存待測(cè)。

　　1.2.4 1氧化氮檢測(cè) NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在離體標(biāo)本液中主要氧化成亞硝酸鹽，因此，測(cè)定標(biāo)本中亞硝酸鹽的濃度可作為衡量NO水平的指標(biāo)。本試驗(yàn)取凍存培養(yǎng)液上清100μl，室溫溶解后，依1氧化氮試劑盒說明書操作，以硝酸還原酶法測(cè)定標(biāo)本液中的亞硝酸鹽濃度，550nm，0.5cm光徑，測(cè)吸光度值。NO含量（μmol/L）＝（測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100μmol/L）。

　　1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測(cè)定值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　各組腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO量隨時(shí)間變化的情況見表1。腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)1h時(shí)，各組間釋放NO量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；培養(yǎng)4h時(shí)，AA+PNS 0.4mg/ml組及AA+DM 10?7mmol/L組與AA組相比NO釋放量升高，差異有顯著性意義（P<0.05）；培養(yǎng)8h時(shí)，AA +PNS 0.2mg/ml組與AA組相比NO釋放量降低，差異有顯著性意義（P<0.05）；同時(shí)AA+PNS 0.4mg/ml組與AA組相比NO釋放量也降低，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；培養(yǎng)24 h，AA+PNS 0.8mg/ml組及AA+DM 10?7mmol/L與AA組相比NO釋放量升高，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；AA+PNS 1.6mg/ml與AA組的差異有顯著性意義（P<0.05）。

　　表1 （略）

　　與AA組比較，*P<0.05，** P<0.01

　　3 討論

　　NO對(duì)免疫系統(tǒng)有雙重作用，既是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用所不可缺少的參與分子，又可由于過量產(chǎn)生而導(dǎo)致組織損傷。NO可促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放許多炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（TNF?α） 和白介素1 （IL?1）等，在免疫性炎癥病理中起重要作用［4］。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）是用于RA發(fā)病機(jī)制研究及抗炎藥物篩選的1種常規(guī)模型，研究表明由誘生型1氧化氮合酶iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，在大鼠AA發(fā)病機(jī)制中起重要作用［5］，AA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)病變與NO的過量產(chǎn)生有關(guān)［6］，對(duì)NO產(chǎn)生的抑制必然可使組織損傷得到1定程度的緩解，起到治療作用［7］。

　　以往有學(xué)者研究PNS對(duì)降低燒傷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO有顯著的作用［8］。本研究結(jié)果顯示，PNS 對(duì)AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的調(diào)節(jié)作用與藥物作用的時(shí)間及劑量有1定關(guān)系，在較小的濃度較短的時(shí)間（PNS0.4mg/ml，培養(yǎng)4h）以及較大的濃度較長(zhǎng)的時(shí)間（PNS0.8mg/ml及PNS1.6mg/ml，培養(yǎng)24h）對(duì)NO的釋放均有促進(jìn)作用，而在1定的濃度和時(shí)間（PNS0.2mg/ml及PNS0.4mg/ml，培養(yǎng)8h）對(duì)NO的釋放有1定的抑制作用。

　　由此可見，PNS體外給藥對(duì)AA大鼠釋放NO有雙向調(diào)節(jié)作用，推測(cè)PNS對(duì)AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用可能在佐劑性關(guān)節(jié)治療中起1定的作用。其雙向調(diào)節(jié)作用的機(jī)制有待于進(jìn)1步的研究證實(shí)。

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