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δ-連環(huán)素在糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元中的表達(dá)
【摘要】 目的 觀察δ-連環(huán)素在大鼠糖尿病模型海馬神經(jīng)元中的表達(dá)特征。方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將大鼠隨機(jī)分成糖尿病組、正常對照組和緩沖劑組。按45 mg/ kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液)誘發(fā)糖尿病,緩沖劑組只給予等量的緩沖液。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測δ-連環(huán)素在各組中的定量表達(dá)。結(jié)果 糖尿病組大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達(dá)明顯低于正常對照組和緩沖劑組，在海馬齒狀回減少尤為明顯。結(jié)論 糖尿病可下調(diào)大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 δ-連環(huán)素;糖尿病;海馬;大鼠;免疫組織化學(xué)
Abstact：Objective To investigate the characteristics of the expression of δ-catenin in diabetic rat hippocampal neurons. Methods The rats were randomized into diabetic, normal control and buffer groups. The rats in the diabetic group were injected with a single dose of 45 mg·kg of STZ (dissolved in 0.1 mol/L sodium citrate buffer) via the caudal vein to induce diabetes mellitus, and the animals in the buffer group received the same dose of sodium citrate buffer alone. The morphological changes of the hippocampal neurons were observed by immunohistochemical method and the quantitative expression of δ-catenin in each group was determined by computer-assisted image analysis system. Result Immunohistochemical method and quantitative assay revealed that the expression of δ-catenin in the diabetic group was the lowest in the three groups, particularly in the dentate gyrus (DG). Conclusion The diabetic functional disorders of the central nervous system may downregulate the expression of δ-catenin.
Key words：δ-catenin; diabetes; hippocampus; rat; immunohistochemistry
糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，可引起認(rèn)知功能障礙及大腦的神經(jīng)生理和結(jié)構(gòu)改變[1-2]。海馬是與腦高級功能相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，在糖尿病患者中易受到損害，表現(xiàn)為更易發(fā)生中風(fēng)、癡呆和認(rèn)知減退[3]。
δ-連環(huán)素屬于P120-catenin蛋白家族，特異性地表達(dá)在神經(jīng)元[4]。研究發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素過表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞形成樹突狀突起，并增加原代海馬細(xì)胞中樹突的形成[5]。已有報道δ-連環(huán)素基因變異小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的學(xué)習(xí)障礙、突觸可塑性降低和突觸成分的改變。糖尿病患者認(rèn)知功能減退的機(jī)制至今不明，在糖尿病動物海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達(dá)變化也鮮有報道。
1 材料和方法
1.1 動物分組及模型制備 SD雄性大鼠，體重 260～300 g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分成正常對照組、緩沖劑組和糖尿病組(n=9)。按文獻(xiàn)[6]方法，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液),緩沖劑組只給予等量的緩沖液。3天后測血糖，血糖>16.7 mmol/L,飲水及尿量明顯增多為造模成功。造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)60天，中間不進(jìn)行胰島素干預(yù)，也不進(jìn)行糖尿病飲食控制，造模后每周監(jiān)測血糖。每組取9只大鼠5%茂巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟先灌注100 ml的生理鹽水后灌注4%多聚甲醛〔0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.3配制〕固定30 min。動物靜置于4℃冰箱3 h后取大腦，用上述固定液后固定約6 h(4℃)。并修取含海馬腦段，經(jīng)20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片機(jī)切片，片厚20 μm。每個動物均依次等距離間隔選取切片,貼片。
1.2 血糖測定 造模3天和取材前內(nèi)眥靜脈取血測血糖,血糖測定采用葡萄糖氧化酶法血糖試劑盒。
1.3 SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng) 切片經(jīng)：①300 mg/L H2O2 20 min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封閉，37℃ 30 min;③δ-連環(huán)素1∶200，4℃ 18 h后，室溫孵育6 h;④生物素標(biāo)記IgG 1∶300，室溫孵育2 h;⑤SABC復(fù)合物1∶300，室溫孵育1 h;⑥3 mg/L H2O2和5 mg/L DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)陽性顆粒后終止反應(yīng)。反應(yīng)步驟③～⑥過程中，每步后均用0.01 mol/L PBS，pH 7.3漂洗3次，每次10 min。切片經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。
1.4 海馬齒狀回DG區(qū)δ-連環(huán)素陽性反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測定分析 每只動物各取進(jìn)行過SABC反應(yīng)的不相鄰切片6張(間隔20 μm)。400倍的高倍鏡下，在海馬DG區(qū)隨機(jī)選取10個視野，采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)對各組δ-連環(huán)素反應(yīng)陽性的細(xì)胞進(jìn)行吸光度的半定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果用SPSS 12.0分析。各組之間差異用單因素方差分析檢驗(yàn)。再用Student-Newman-Keuls進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果用±s表示。P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
2 結(jié) 果
2.1 大鼠海馬區(qū)δ-連環(huán)素的表達(dá) 結(jié)果顯示δ-連環(huán)素免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，在海馬各亞區(qū)的神經(jīng)元胞質(zhì)和胞膜中均有表達(dá)。顯微鏡下觀察到，正常對照組(圖1B，E)和緩沖劑組(圖1C、F)大鼠海馬神經(jīng)元中的δ-連環(huán)素免疫反應(yīng)的陽性顆粒色深密集，均明顯高于糖尿病組(圖1A、1D)。在海馬齒狀回(DG區(qū))δ-連環(huán)素主要表達(dá)于顆粒層和顆粒下層，少量表達(dá)于門區(qū)。大鼠海馬齒狀回δ-連環(huán)素的表達(dá)在糖尿病組減少更加明顯。正常對照組和緩沖劑組間大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的免疫反應(yīng)差異不明顯。
圖1 δ-連環(huán)素catenin在各組大鼠海馬神經(jīng)元中表達(dá)
其中A(×40)和D(×400)為糖尿病組，B(×40)和E(×400)為正常對照組，C(×40)和F(×400)為緩沖劑組
2.2 海馬齒狀回(DG)δ-連環(huán)素陽性反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測定分析 正常組和緩沖劑組海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素吸光度(absorbance)(A)無明顯差異，但分別高于糖尿病組304%和291%，其差別具有顯著性意義。見表1。表1 各組大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達(dá)的定量分析結(jié)果
3 討 論
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素在糖尿病組海馬神經(jīng)元中的表達(dá)低于正常對照組和緩沖劑組，提示大鼠糖尿病的神經(jīng)性損害對海馬神經(jīng)元δ-連環(huán)素的表達(dá)產(chǎn)生了下調(diào)作用。
文獻(xiàn)報道在糖尿病小鼠大腦中海馬神經(jīng)元的發(fā)生不足，數(shù)量降低。DG區(qū)海馬神經(jīng)元的發(fā)生可能與一定的記憶相關(guān)[7]。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠海馬各亞區(qū)神經(jīng)元變大腫脹，空泡樣變，胞膜破損，及δ-連環(huán)素在DG區(qū)表達(dá)明顯減少，表明δ-連環(huán)素表達(dá)的減少在糖尿病大鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶功能減退方面可能發(fā)揮一定作用。
δ-連環(huán)素參與鈣黏連蛋白-連環(huán)素復(fù)合體的構(gòu)成，在突觸后膜與包括PSD95在內(nèi)的PSD蛋白組分相互作用，并且在C末端包含1個PZD結(jié)合序列[8]。信號復(fù)合體(signalosome)是近年發(fā)現(xiàn)的激素對細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)的一種組合模式。已有文獻(xiàn)報道，雌激素與PSD95對神經(jīng)元突起和突觸的結(jié)構(gòu)調(diào)控，正是通過信號復(fù)合體的模式進(jìn)行的[9]，在這一過程中，雌激素與PSD95形成signalosome。當(dāng)雌激素與PSD95形成signalosome后能夠?qū)ι窠?jīng)元突起和樹突棘生長產(chǎn)生調(diào)控作用。推測由糖尿病胰島素降低而產(chǎn)生上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能也是通過這種方式。另外在突觸后膜δ-連環(huán)素也可能通過PZD結(jié)構(gòu)域在不同的亞細(xì)胞區(qū)域與其他的蛋白相互作用[8，10]，而胰島素的降低可能促進(jìn)了δ-連環(huán)素與其他的蛋白的相互作用，從而改變突觸塑型，進(jìn)而引起認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶功能減退。關(guān)于δ-連環(huán)素在糖尿病神經(jīng)損傷過程中的分子生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。
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