抗腫瘤藥氯法拉濱的致突變性及溶血性研究

時間：2024-10-03 10:09:01 臨床醫(yī)學畢業(yè)論文我要投稿

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抗腫瘤藥氯法拉濱的致突變性及溶血性研究

【摘要】目的了解氯法拉濱(簡稱CLO)對骨髓紅細胞和雄性小鼠生殖細胞有無致突變和致畸作用，以及對外周血紅細胞有無溶解作用。方法采用微核試驗檢測CLO對骨髓RBC的致突變性，采用精子畸變試驗檢測CLO對小鼠生殖細胞的致畸作用，采用人紅細胞檢測CLO的溶血性。結果經微核試驗，CLO測試組與陽性對照組兩組間差異無顯著性(P>0.01)，與陰性對照組間差異有顯著性(P<0.05)。精子畸變試驗中，CLO測試組與陽性對照組之間差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組之間差異有顯著性(P<0.01)。CLO在體外各時段不致人紅細胞溶解。結論經檢測，CLO同其他抗癌核苷酸類似藥一樣，可以引起體內增殖活性強的細胞的突變，以及生殖細胞的畸變;對人紅細胞的溶解性為陰性。

抗腫瘤藥氯法拉濱的致突變性及溶血性研究

【關鍵詞】氯法拉濱;微核試驗;精子畸變試驗;溶血性;致畸;致突變

多數抗白血病藥物的藥理作用是以抑制腫瘤細胞DNA合成以及抑制某些聚合酶的作用從而阻止腫瘤細胞增殖為特征。所以，世界衛(wèi)生組織(WHO)曾宣布：從DNA入手才是治療腫瘤的關鍵。氯法拉濱(簡稱CLO)即是如此，作為一種核苷酸還原酶抑制劑，可以使腫瘤細胞DNA合成終止達到殺傷腫瘤細胞的作用[1]，那么對正常機體的生殖細胞、骨髓紅細胞及外周血紅細胞的影響是怎樣的呢?我們即對此進行了研究。本研究是以小白鼠和體外人紅細胞為實驗對象來了解CLO對它們的反應性。應用統(tǒng)計學方法，為評價CLO對生殖細胞畸變，對骨髓紅細胞致突變作用的影響規(guī)律，以及對人紅細胞的作用機制提供科學依據。

　　1 實驗材料

　　1.1 藥品與試劑 CLO制劑：某兄弟院校贈予。陽性對照物：環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)有限公司，批號20070302。陰性對照物：生理鹽水。Giemsa染液。pH6.8磷酸鹽緩沖液。

　　1.2 實驗儀器醫(yī)用離心機：TL80-1型，中國姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司。恒溫水浴箱：TL-420D型，天力醫(yī)療器械有限公司。顯微鏡：日本OLYMPAS株式會社出品，型號CX200。

　　1.3 動物 8～12周齡昆明種小白鼠100只，雄性75只，雌性25只，由山東大學醫(yī)學院新藥評價中心提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK魯20030004。

　　2 實驗方法

　　2.1 微核試驗[2～4]

　　2.1.1 CLO試驗組選用昆明種成年小鼠30只，雌雄各半，運達本室后稱重標記，體重23～27g。飼養(yǎng)1周，以觀察其健康狀況使其適應本室環(huán)境，適當控制飲食，1周內使體重變化在4g左右。將CLO配成1mg/ml的濃度。給藥：小鼠按200mg/kg灌胃給藥，連續(xù)1周。骨髓涂片：第八天頸椎脫臼致死小鼠，解剖剪取胸骨;載玻片上滴加小牛血清，用止血鉗擠壓胸骨骨髓液點加于血清中�；靹�，推片，自然干燥后滴加甲醇覆蓋涂膜固定。染色：Giemsa染色，將固定好的涂片滴加Giemsa應用液，根據室溫染色維持10～15min后，加2倍pH6.8磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)染3～5min，用PBS沖洗，晾干。觀察計數：用雙盲法閱片，高倍鏡下觀察計數嗜多染紅細胞的微核發(fā)生率，每只動物計數1000個細胞。

　　2.1.2 陽性對照小鼠10只，雌雄各半，飼養(yǎng)方法、條件同上。取針劑環(huán)磷酰胺200mg，加生理鹽水8ml，再作1：10稀釋，使之成為2.5mg/ml的濃度。每只小鼠按40mg/(kg·d)做腹腔注射，連續(xù)2天，間隔24h，末次注射后6h處死，取骨髓細胞方法、染色方法、觀察計數同CLO試驗組，計數陽性對照組的微核率。

　　2.1.3 陰性對照取小鼠10只，雌雄各半，稱重后以0.4ml/(25g·d)的劑量以生理鹽水灌胃連續(xù)7天，計數微核率方法同上。

　　2.2 精子畸變試驗此項試驗選用健康雄性小鼠，體重23～27g。

　　2.2.1 CLO試驗組選用健康雄性昆明種小鼠30只，以CLO 20mg/kg灌胃給藥7天后，處死小鼠、摘除附睪，用生理鹽水將血液漂洗干凈，置小燒杯中，用剪刀將附睪縱向剪開，加生理鹽水1～1.5ml，用滴管反復適度吹打，使精子均勻散在液體中，靜置1min。取上層懸液1滴，加在干凈的載玻片上，蓋上蓋片，立即用高倍鏡觀察，檢查精子的頭部、體部和尾部的形態(tài)變化。以形態(tài)良好，游動活潑的精子為正常。以無頭、小頭、胖頭、雙頭、雙尾、無尾及無定形為精子畸形[3，5]，計數1000個精子的畸變率。

　　2.2.2 陽性對照試驗取雄性小鼠10只，腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg[5]，相當于體積劑量為0.4ml/(25g·d)，連續(xù)5天，取精子方法、計數精子畸變率法同試驗組。

　　2.2.3 陰性對照取雄性小鼠10只，以0.4ml/(25g·d)的劑量做腹腔注射生理鹽水，連續(xù)7天，用藥時間、取精子方法、計數畸變率同試驗組。

　　2.3 溶血性試驗 CLO測試物溶液以1mg/ml為原液進行稀釋。

　　2.3.1 試管設定分設陽性對照、陰性對照試管各1支，測試管1～5號，共7支。

　　2.3.2 紅細胞懸液的制備無菌抽取健康志愿者O型血5ml，置50ml無菌錐形瓶中用玻璃珠搖晃去除纖維蛋白，然后分取1/2移入2支10ml刻度離心管中，各加入生理鹽水5ml，混勻，離心1500rpm 10min，棄上清，洗2次。將所得紅細胞用生理鹽水稀釋成2%，備用[6]。

　　2.3.3 加樣取試管7支，編號。按表1所示，分別加入各溶液。表1 溶血性試驗加樣表 (ml)

　　第6管不加CLO溶液，只加紅細胞溶液及生理鹽水作為陰性對照;第7管不加CLO溶液和生理鹽水，只加紅細胞溶液和蒸餾水作陽性對照。1～5管為測試管，加入不同體積的CLO溶液和不同體積的生理鹽水，使其成為遞減的終濃度。將各管置于試管架上輕輕搖勻，置37℃中進行恒溫水浴4h，分不同時段觀察各管的溶血和凝集現象，必要時用顯微鏡觀察紅細胞是否完整。顯微鏡觀察方法：將試管輕輕搖勻，取溶液20μl，滴于載玻片上，蓋上蓋片，高倍鏡觀察細胞的有無及完整性。

　　3 實驗結果

　　3.1 微核試驗小鼠骨髓片經Giemsa染色后進行閱片，選擇細胞完整、分布均勻，著色適度的區(qū)域，用高倍鏡觀察[1]。鏡下：嗜多染紅細胞呈灰白色，因成熟紅細胞核糖體消失，被染成淡桔紅色，微核大多情況下呈單個圓形，邊緣光滑整齊，游離于細胞質中，嗜色性與核質相一致，呈紫紅色或藍紫色，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5，故稱為微核。CLO測試物與陽性對照、陰性對照的微核發(fā)生率及其對照如表2所示。表2 CLO微核率與陽性對照、陰性對照實驗結果

　　注：*CLO測試組與陽性對照,陰性對照的比較結果 CLO測試物與陽性對照和陰性對照的關系分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，所得數據用均數±標準差(〖x〗±SD)表示。經分析表明，CLO測試組與陽性對照組兩者之間差異無顯著性(P>0.01)，CLO測試組與陰性對照比較差異有顯著性(P<0.05)。因此推斷，抗癌新藥CLO對骨髓紅細胞有一定的致突變作用。

　　3.2 精子畸變試驗高倍鏡觀察：每只小鼠計數1000個精子，分計出正常與異常精子。統(tǒng)計學處理：使用SPSS13.0軟件對統(tǒng)計數據進行χ2檢驗，組間比較用χ2分割法。結果見表3。表3 CLO精子畸變與陽性對照、陰性對照實驗結果及比較

　　結果表明：精子畸變試驗中，CLO測試組與陽性對照組差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.01)。因此，CLO對雄性昆明種小鼠有誘導遺傳突變、精子致畸作用。

　　3.3 溶血性試驗在37℃水浴中，每隔15min觀察1次，4次后每隔1h觀察1次，共7次，有疑問者取20μl做壓片，顯微鏡觀察。實驗結果判定參見表4。根據以上標準，CLO溶血性試驗結果見表5。表4 紅細胞溶血、凝血判斷標準表5 CLO溶血性試驗結果

　　蒸餾水陽性對照管在15min觀察，溶液紅色透明，管底無紅細胞沉淀，鏡下無細胞，即為全部溶血。生理鹽水陰性對照管和1～5號CLO測試管各時段均為上部無色透明，紅細胞全部沉入管底，搖后紅細胞分散，液體呈紅色混濁。顯微鏡下觀察形態(tài)，數量正常，表示不溶血。

　　4 討論

　　4.1 CLO對小鼠骨髓嗜多染紅細胞形成微核的效應我們采用的小鼠微核試驗是20世紀70年代初建立的一種利用哺乳動物骨髓細胞染色體改變來測定突變作用的實驗方法。具有檢測對骨髓細胞作用及染色體損傷效應的方便、快捷、可靠的特點。已被國際組織如國際經濟合作和發(fā)展組織(OECD)、國際誘變劑、致癌劑防護委員會(ICPEMC)等推薦為檢測致癌劑、誘變劑廣泛應用的遺傳毒理學方法之一[7～9]。因此，我們利用微核試驗作為實驗手段是可行的。微核的形成，起因于染色體斷片或有絲分裂器紊亂，是由染色體斷片或整條染色體在細胞分裂后期，不能移到細胞紡錘體兩極而游離于細胞漿中而形成的。致斷裂物質和紡錘體抑制劑都能導致微核的形成。CLO作為一種核苷酸類似物[8～10]，其經脫氧胞苷激酶磷酸化為三磷酸鹽。首先能有效地抑制核苷酸還原酶，使DNA合成終止;同時也能抑制DNA聚合酶a ，使DNA鏈不再延長，形成染色體斷片。CLO對不同的細胞株和腫瘤模型都表現出很強的抗癌活性，因此，具有較強的細胞毒性。有報道稱[1]，在2mg/m2的濃度劑量下，干細胞中CLO的代謝產物三磷酸鹽水平持續(xù)保持較高水平，此水平可持續(xù)抑制DNA的合成。目前，抗腫瘤藥物的特點是治療指數較小，選擇性較差。在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞特別是增殖更新較快的正常組織如骨髓、胃腸黏膜上皮、淋巴組織、毛囊和生殖細胞等產生不同程度的損害[10]。因此，在骨髓紅細胞的增殖過程中，可引起染色體有絲分裂紊亂而形成微核是必然的。我們的實驗結果，CLO與陽性對照組差異無顯著性(P>0.01)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.05)，與有關報道[1]相一致。

　　4.2 CLO對雄性小鼠生殖細胞的影響精子畸變試驗是判斷化合物是否具有生殖毒性的常用方法[3，5]，也是檢測致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理學方法，它是以精子的畸變率來評價化合物的生殖毒性和誘變性的。此試驗簡單、經濟，可重復性強，實驗終點明確，結果陽性的化合物可認為是哺乳動物生殖細胞的潛在誘變劑。在本研究中，精子畸變試驗的陽性對照環(huán)磷酰胺和陰性對照的生理鹽水兩組間比較，差異有顯著性(P<0.01)，證明本試驗系統(tǒng)具有可靠性[3，11，12]。研究結果表明，CLO測試組精子畸變率與陽性對照組差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.01)。因此，CLO對雄性昆明種小鼠有精子致畸作用，即可誘導遺傳突變。測試物誘變的作用機制在于誘發(fā)小鼠初級精母細胞染色體畸變，初級精母細胞染色體的變化，主要原因分析為細胞增殖周期中期的終變細胞DNA損傷而導致的[10]。

　　4.3 CLO對體外紅細胞的溶解性對于一種新藥的處方工藝研究，溶血性亦是一個重要的篩選指標。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理局審評中心所發(fā)布的溶血試驗指導原則，是使用常規(guī)肉眼觀察法檢測制劑的溶血性。用該法檢測CLO的溶血性時，各時段均未有溶血現象，表明CLO的滲透壓及pH值與人紅細胞相一致，對紅細胞膜有很好的保護作用。據報道[1]，CLO對不同的細胞株和腫瘤模型都表現出很強的抗癌活性。研究表明，本品的濃度水平在微摩爾以下就能有效地抑制人體CNS腫瘤，如肺癌、腎癌、白血病細胞和黑色素瘤細胞等的增殖。在一定劑量下[4mg/(m2·d)],也會導致明顯的骨髓抑制。這與我們的研究中涉及的微核試驗和精子畸變試驗是相一致的。以往的生物試驗和醫(yī)學試驗表明[11～13]，小鼠得出的研究結果一般也適用于人類。所以，可以推斷，CLO在抑制腫瘤細胞的同時，對人類的染色體及精子細胞有一定的誘變作用。這需引起人們的高度重視，有必要從多種角度對其進行安全性評估。建議長期用藥時一定要注意用藥劑量，安全用藥。

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