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研非復(fù)制性腺病毒攜帶AT2
0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先報(bào)道，用細(xì)胞雜交技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細(xì)胞，與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，并由此創(chuàng)建了第一個(gè)B 細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC 的單克隆抗體。他們首先創(chuàng)立了將能分泌特異性抗體的B 淋巴細(xì)胞同無(wú)限繁殖的骨髓瘤細(xì)胞融合技術(shù)，為單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。這是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑。
單克隆抗體以特異性高、性質(zhì)均一和針對(duì)特定靶點(diǎn)定向制備等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療，特別是在腫瘤領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用備受關(guān)注。美國(guó)FDA 先后批準(zhǔn)了10 多個(gè)用于治療腫瘤的抗體藥物，都是全長(zhǎng)抗體。雖然單克隆抗體在腫瘤治療中發(fā)揮了重要的作用，但全長(zhǎng)單克隆抗體治療腫瘤成本太高：治療腫瘤的抗體需要量極多且純度要求高，目前的生物制藥工藝難以滿足市場(chǎng)的需求，大規(guī)模、高密度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前國(guó)際上的一大難題，這些均導(dǎo)致高生產(chǎn)成本及昂貴的價(jià)格，一般患者難以承受。
因此，本課題的目的是利用非增殖腺病毒作為載體攜帶全長(zhǎng)抗體基因在體內(nèi)表達(dá)全長(zhǎng)抗體，這樣可以避免在體外用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體，以及純化等復(fù)雜而且昂貴的規(guī)程。AT2是一個(gè)對(duì)腫瘤有明顯療效的抗EGFR 單克隆抗體Cetuximab。由于EGFR 在很多腫瘤中都有過(guò)量表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、抗藥性和轉(zhuǎn)移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 對(duì)過(guò)量表達(dá)EGFR 的腫瘤有良好的治療作用，現(xiàn)已被批準(zhǔn)用于頭頸癌、直腸癌和肺癌的治療，無(wú)論是單獨(dú)使用還是與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用都有很好的效果，只有很小的副作用，出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)的概率不及萬(wàn)分之一。Cetuximab 單抗應(yīng)用其它腫瘤治療的研究也在大力的開(kāi)發(fā)中，在腫瘤的治療中有很大應(yīng)用前景，但是由于其生產(chǎn)成本過(guò)高，國(guó)內(nèi)普通患者難以承擔(dān)，而抗體基因治療正好解決了這個(gè)問(wèn)題。本研究根據(jù)人體內(nèi)密碼子的偏愛(ài)性選擇修改了部分氨基酸密碼子，構(gòu)建了修改密碼子后的重組腺病毒載體。體外實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)修改密碼子后提高了抗體的表達(dá)量，通過(guò)Western 和IFN 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，無(wú)論修改密碼子與否，重組腺病毒在293 細(xì)胞中表達(dá)的抗體與商品化的 Cetuximab 單抗相近的特性，分子量大小一致，與抗原EGFR 有很好的結(jié)合，說(shuō)明我們構(gòu)建的載體表達(dá)的抗體是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鱗癌細(xì)胞株A431、SK-Br-3 細(xì)胞和人胚胎腎細(xì)胞293 細(xì)胞(購(gòu)于ATCC)，DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清FBS(購(gòu)于GIBCO 公司),穿梭載體pDC339 (本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。引物和抗體基因由上海生工公司合成。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)A431 細(xì)胞、SK-Br-3 細(xì)胞和293 細(xì)胞在5%CO2，37℃ 條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM。
1.2.2 構(gòu)建攜帶抗體基因重組
腺病毒載體我們首先分別合成修改密碼子前后的AT2 抗體基因的輕鏈及重鏈，且在輕鏈及重鏈前面各自合成抗體的信號(hào)肽基因，用IRES 元件連接抗體的輕鏈和重鏈基因，以實(shí)現(xiàn)AT2 抗體的重鏈和輕鏈的平衡性及完整性，經(jīng)PCR 引入酶切位點(diǎn)后，逐步把重輕鏈基因裝入載體pDC339 中。
經(jīng)過(guò)酶切和 PCR 鑒定后測(cè)序。PCR 鑒定穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改過(guò)密碼子)重、輕鏈的引物分別是GT340+GT341（輕鏈）、GT342+ GT343（重鏈）和ATNL-1+ ATNL-4（輕鏈）、 ATNH-1 +ATNH-4（重鏈）。測(cè)序正確后的穿梭載體與5 型腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3 利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染至293 細(xì)胞，通過(guò)同源重組的方法獲得攜帶目的基因的重組病毒。共轉(zhuǎn)染后9～14 d 出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)PCR 法鑒定目的基因正確后，得到表達(dá)Cetuximab 抗體的重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。簡(jiǎn)化示意圖如下：
1.2.3 病毒擴(kuò)增和純化
病毒滴度測(cè)定重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 經(jīng)鑒定正確后進(jìn)行大擴(kuò)后，用HPLC 法在純化車(chē)間純化，應(yīng)用50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測(cè)定病毒滴度。
1.2.4 重組腺病毒表達(dá)的抗體檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)鋪板 293 細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后，按MOI=10 分別加入兩個(gè)病毒，收上清用于抗體的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用雙夾心ELISA 法測(cè)定抗體的表達(dá)量；用Western 鑒定其與商品化的Cetuximab 單抗比較分子量大��；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，用熒光標(biāo)記抗體作為分子探針，檢查抗體Cetuximab 與A431 細(xì)胞膜上的抗原EGFR 結(jié)合的特異性，同時(shí)用EGFR 陰性的SK-Br-3 細(xì)胞做陰性對(duì)照。
2. 結(jié)果
腺病毒穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鑒定結(jié)果。
應(yīng)用50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測(cè)定病毒滴度，Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 的病毒滴度分別是1.2×1010pfu/ml，1.0×1010pfu/ml。
用雙夾心 ELISA法測(cè)定病毒抗體的表達(dá)量：Ad-AT2 與Ad-NAT2 相比的表達(dá)量分別是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通過(guò)修改密碼子較大的提高了抗體的表達(dá)量。
重組腺病毒Ad-AT2、Ad339-NAT2 按MOI＝10 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株293，感染72 小時(shí)后用Western Blot 方法檢測(cè)細(xì)胞上清中Cetuximab 抗體與商品化的抗體比較分子量大小。查看EFNB2與精神分裂癥樣本的關(guān)聯(lián)。
3 討論
治療各種疾病、頑癥中有巨大的優(yōu)勢(shì)，但是由于其自身的某些性質(zhì)，加上目前我們的生產(chǎn)抗體的技術(shù)和工藝，限制了抗體的應(yīng)用。在當(dāng)前的生產(chǎn)抗體的工藝比較復(fù)雜，需要綜合多項(xiàng)技術(shù)，工藝和技術(shù)都被少數(shù)公司壟斷，而且抗體的需要量也在增大，最后導(dǎo)致抗體的治療成本極高。
為了降低成本和提高抗體治療效果，基因治療是一種新型有效的手段，我們可以通過(guò)把全長(zhǎng)抗體基因裝入載體，通過(guò)載體帶進(jìn)體內(nèi)，是抗體在體內(nèi)表達(dá)。這樣既可以免去體外生產(chǎn)抗體眾多復(fù)雜的過(guò)程，降低成本，又可以使抗體更好的在體內(nèi)持續(xù)作用，更好的到達(dá)組織。
因此，如何找到一個(gè)安全的，有效的載體是關(guān)鍵。腺病毒成為一個(gè)重要的載體，由于我們對(duì)其研究得比較清楚，我們對(duì)其進(jìn)行改造，刪除負(fù)責(zé)病毒復(fù)制的E1A 區(qū)以及其它多余的區(qū)域。
腺病毒作為載體應(yīng)用于基因治療中有眾多優(yōu)點(diǎn)，在目前的條件下，腺病毒載體相對(duì)于其它載體，更適合作為基因治療的載體。
根據(jù)密碼子的偏愛(ài)性，我們收集了高表達(dá)的氨基酸密碼子，修改了部分抗體基因的密碼子，以此來(lái)提高抗體的表達(dá)量。經(jīng)Western 鑒定和IFN 實(shí)驗(yàn)證明腺病毒載體表達(dá)的抗體是完整和有活性的，特異性也很好，可以應(yīng)用下一步的治療研究。
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