淺究微波輔助提取白頭翁皂苷
微波輔助提取具有選擇性高、用時短、加熱均勻、溶劑消耗少、有效成分提取率高等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分提取分離中。
摘要：利用響應(yīng)面法對白頭翁(Pulsatilla chinensis)皂苷的微波提取條件進行了優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理及響應(yīng)面法分析并建立二次回歸模型。以乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應(yīng)值，研究了各因素對白頭翁皂苷提取率的影響。確定最佳微波提取條件為乙醇體積分數(shù)50%、微波功率300 W、微波時間4 min，在此條件下，白頭翁皂苷提取率達到5.33%。
關(guān)鍵詞：白頭翁(Pulsatilla chinensis);皂苷;響應(yīng)面法;微波輔助提取
中藥白頭翁為毛茛科植物白頭翁(Pulsatilla chinensis)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味苦寒，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲之功效[1，2]。它的化學(xué)成分有白頭翁皂苷、胡蘿卜甙、白頭翁素等，主要有效成分為白頭翁三萜皂苷[3，4]。現(xiàn)代藥理研究表明，它具有增強免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗腫瘤及抗癌的新藥開發(fā)方面有很大的應(yīng)用潛力[7，8]。近年研究還發(fā)現(xiàn)其所含的某些活性成分對治療老年性癡呆(阿爾茨海默病)效果顯著[9，10]。
微波輔助提取技術(shù)(MAE)利用每秒幾億次周期變化的微波透入物料內(nèi)，使物料內(nèi)的各部分在同一瞬間獲得能量促使細胞破裂，使細胞液溢出并擴散到溶劑中，從而達到提取有效成分的目的[11]，具有省時、高效，操作簡便、提取成本低等優(yōu)點[12]。本研究以白頭翁為原料，白頭翁皂苷B4含量為指標，采用微波輔助溶劑提取白頭翁皂苷，考察了乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，并通過響應(yīng)面法對主要因素進行了優(yōu)化，旨在為白頭翁皂苷的綜合利用提供借鑒和參考。
一、材料與方法
1.1 材料與試劑
白頭翁干燥根，購自牡丹江市老百姓大藥房;白頭翁皂苷B4標準品，純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)，J&K CHEMICAL LTD公司;甲醇、乙醇(分析純);水為實驗室自制超純水。
SB-5200DTN型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);XH-MC-1型實驗室微波合成儀(祥鵠科技發(fā)展公司);Waters 2695型高效液相色譜儀(Waters公司);Waters 2998型紫外檢測器(Waters公司);色譜柱(4.6 mm×150 mm);MF 22R型臺式微量冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司);BSA2245S-CW型電子分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);FZ102微型植物粉碎機(蘇州江東精密儀器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 標準曲線的制作 精密稱取白頭翁皂苷B4標準品3.00 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容配得濃度為0.600 mg/mL的母液，梯度稀釋為0.600、0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的標準品溶液，分別標記為1、2、3、4、5、6，經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，依次取6組標準品溶液，在檢測波長為201 nm，流動相為乙腈∶水∶磷酸(27∶73∶0.1)，等度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min;25 ℃柱溫的高效液相色譜條件下進樣10 μL。繪制標準曲線，得出回歸方程。
1.2.2 單因素試驗 將白頭翁干燥根于微型植物粉碎機中粉碎，0^50目篩，準確稱取5.0 g，若干份，分別加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，配制成不同料液比(g∶mL，下同)的樣品溶液，在一定的微波功率下提取一定的'時間，趁熱抽濾，4 000 r/min離心10 min，取上清液入高效液相色譜儀，將得到的峰面積代入回歸方程，依下式計算白頭翁皂苷B4提取率，重復(fù)操作3次取平均值，考察不同因素對白頭翁皂苷提取率的影響。
式中，Y為提取率，%;C為目的成分的濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;M為原料重量，g。
1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 綜合單因素試驗的分析結(jié)果，選擇乙醇體積分數(shù)、微波功率及微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計試驗，見表1。
二、結(jié)果與分析
2.1 標準曲線方程
以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到回歸方程為Y=2 586.4X-26.734，R2=0.999 6，白頭翁皂苷在0.025～0.600 mg/mL。
2.2 單因素試驗結(jié)果
單因素試驗結(jié)果見圖1。初步選定過50目的白頭翁粉末，乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶8、微波功率300 W、微波時間4 min為最佳提取條件，采用響應(yīng)面法對微波輔助提取白頭翁皂苷的條件進行優(yōu)化。
2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果
2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 通過軟件Design expert 7.0對試驗設(shè)計及結(jié)果(表2)中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，可得到白頭翁皂苷提取率與各個影響因素之間的關(guān)系模型為：
Y=5.150-0.021A-0.100B+0.081C-0.031AB-0.410AC+0.490BC-0.500A2-0.620B2-0.160C2
在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，對一次項系數(shù)進行分析可知，各因素影響順序為：乙醇體積分數(shù)<微波時間<微波功率。對模型的各項因素數(shù)據(jù)進行方差分析，具體結(jié)果見表3。由表3可知，整個響應(yīng)面的回歸方程模型的P值小于0.01，呈極顯著水平，而失擬項F=2.14，P=0.238 1，二者均大于0.05可知，失擬項不顯著，且試驗誤差小，說明這是一項擬合度較高的回歸模型;此外，該模型R2=0.967 5，模型校對系數(shù)R2adj=0.925 8，表明模型可以解釋92.58%的響應(yīng)值變化范圍，因此，該模型可以對微波輔助溶劑法提取白頭翁皂苷效果進行分析和預(yù)測。
2.3.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖形是反映響應(yīng)值與各個試驗因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數(shù)與最佳參數(shù)間的相互作用關(guān)系[13，14]。基于二次回歸模型進行響應(yīng)面繪圖，分別給出了各因素間交互影響顯著的響應(yīng)面圖(圖2)。3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間3個因素與白頭翁皂苷的提取率呈拋物線關(guān)系，各因素對白頭翁皂苷提取效果的影響較為顯著，且在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極高值。乙醇體積分數(shù)在45%～55%，微波功率在250～350 W，微波時間在3～5 min的范圍內(nèi)有較大的響應(yīng)值。運用 Design expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進行優(yōu)化，得出皂苷提取率最大時乙醇體積分數(shù)48.7%、微波功率295.8 W、微波時間4.25 min，考慮到操作的簡便及實際情況，選擇最優(yōu)條件為微波時間4 min、微波功率300 W、乙醇體積分數(shù)50%。采用上述優(yōu)化條件進行重復(fù)試驗，得出實際提取率為5.33%。因此，在實際應(yīng)用提取時，可利用本研究響應(yīng)面法優(yōu)化后的提取條件，該參數(shù)可靠、準確、實用。
三、結(jié)論
微波輔助溶劑提取法進行了單因素試驗研究，考察了料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，發(fā)現(xiàn)微波功率、微波時間、乙醇體積分數(shù)的影響較為顯著，因此，利用Design expert 7.0軟件的響應(yīng)面設(shè)計對主要影響因素進行了優(yōu)化，得出各因素的影響順序：微波功率>微波時間>乙醇體積分數(shù)，確定最佳微波提取條件為乙醇體積分數(shù)50%、微波功率300 W、微波時間4 min，此條件下白頭翁皂苷提取率達到5.33%。
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